在兩步法中，有三種不同的方法可用于引發(fā)cDNA反應(yīng)：oligo(dT) 引物、隨機(jī)引物、或序列特異性引物（作用方式如下圖）。通常情況下，是將 oligo(dT) 引物和隨機(jī)引物進(jìn)行混合使用。這些引物退火至模板 mRNA 鏈，并提供給逆轉(zhuǎn)錄酶一個(gè)用于合成的起點(diǎn)位置。

三種引物的特征和優(yōu)缺點(diǎn)比較如下：

逆轉(zhuǎn)錄酶是利用 RNA 合成 DNA 的一種酶。一部分逆轉(zhuǎn)錄酶具有 RNA 酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解 RNA-DNA 雜交鏈中的 RNA 鏈。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以獲得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。對于 RT-qPCR 來說，理想的情況下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶，這樣 cDNA 的合成能夠在較高的溫度下進(jìn)行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的 RNA，同時(shí)保持其在整個(gè)反應(yīng)過程中的全部活性，從而得到更高的 cDNA 產(chǎn)量。

RNase H 能夠從 RNA-DNA 雙鏈中降解 RNA 鏈，從而允許雙鏈 DNA 的有效合成。然而，當(dāng)使用長 mRNA 作為模板，RNA 可能被過早的降解，從而導(dǎo)致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆過程中，如果需要合成長的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，盡量減小 RNase H 的活性通常是有益的。與此相反，擁有 RNase H 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶通常有利于 qPCR 的應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兡軌蛟?PCR 的第一個(gè)循環(huán)中提高 RNA-DNA 雙鏈的熔解。