影響因子：10.3

研究概述：盡管治療取得了重大進(jìn)展，但肺癌仍然是癌癥相關(guān)死亡的主要原因?？钩绦蛐约?xì)胞死亡蛋白-1 （PD-1）療法已成為一線希望之光，作為晚期非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC） 患者的一線治療選擇顯示出可喜的結(jié)果。然而，對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的反應(yīng)率仍然不高，耐藥性問題仍然是一個(gè)重大問題。各種生物標(biāo)志物，包括程序性死亡配體 1（PD-L1）表達(dá)、突變負(fù)荷、錯(cuò)配修復(fù)缺陷、浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和炎癥基因表達(dá)已被廣泛研究以預(yù)測(cè) ICI 的有效性，然而觀察到的結(jié)果并未達(dá)到預(yù)期的成功水平，因此迫切需要能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè) ICI 有效性的更特異性生物標(biāo)志物。脂質(zhì)代謝異常是在癌癥中觀察到的顯著代謝變化，癌細(xì)胞利用脂質(zhì)代謝來獲取能量，合成生物膜，并增強(qiáng)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，這種改變會(huì)顯著影響腫瘤微環(huán)境和對(duì)癌癥治療的反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致免疫抑制表型，因?yàn)樗c復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境廣泛相互作用。最近的研究表明，脂質(zhì)代謝異常癌癥患者阻礙了抗 PD-1 單藥治療的療效。因此，靶向改變的脂質(zhì)代謝途徑已成為一種可能有前途的抗癌治療策略。在這項(xiàng)研究中，作者對(duì)TCGA-LUAD患者的脂質(zhì)代謝模式進(jìn)行了全面分析，研究了這些模式與腫瘤免疫微環(huán)境之間的相關(guān)性，以開發(fā)脂質(zhì)代謝評(píng)分（LMS）系統(tǒng)并確定抗 PD-1 單藥治療的潛在致敏劑。

研究結(jié)果：

基于 LUAD 脂質(zhì)代謝譜的脂質(zhì)代謝評(píng)分系統(tǒng)的構(gòu)建

基于97個(gè)脂質(zhì)代謝基因，作者對(duì)TCGA-LUAD隊(duì)列進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類，產(chǎn)生了兩個(gè)不同的pattern。為了研究不同脂質(zhì)代謝模式的生物學(xué)行為，作者進(jìn)行了GSVA富集分析，結(jié)果表明HALLMARK 數(shù)據(jù)集中的 50 條通路在兩個(gè)亞群中均顯著富集。具體來說，Pattern2 在 HALLMARK DNA REPAIR、HALLMARK E2F TARGETS、HALLMARK HYPOXIA 等通路中表現(xiàn)出富集（圖 1A）。此外，作者研究了兩種脂質(zhì)代謝模式的腫瘤微環(huán)境概況，觀察到亞群之間的大多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)存在顯著差異（圖 1B、C）。此外，與 Pattern2 相比，Pattern1 表現(xiàn)出較低的基質(zhì)評(píng)分和總 ESTIMATE 評(píng)分（圖 1D-F），而 Pattern2 的腫瘤純度顯著更高（圖 1G）。然而，免疫評(píng)分未顯示兩個(gè)亞群之間的顯著差異（圖 1E）。

為了探索與不同脂質(zhì)代謝模式相關(guān)的基因的生物學(xué)相關(guān)性，作者采用 limma R 軟件包來精確定位兩群之間共594個(gè)差異基因，這些基因在兩種脂質(zhì)代謝模式中都顯示出顯著富集。KEGG分析顯示，DEGs 在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用和細(xì)胞周期等途徑中顯著富集（圖 1H）。然后，我們使用 594 個(gè) DEGs 進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，將腫瘤樣本分類為不同的基因組亞型 geneCluster1 和 geneCluster2。結(jié)果與脂質(zhì)代謝模式的聚類分組一致，揭示了兩種不同的脂質(zhì)代謝基因組表型，geneCluster1 和 geneCluster2，geneCluster2 的總生存期較差（圖 1I）。此外，作者觀察到不同基因組亞型患者的臨床特征分布存在顯著差異（圖 1J）。作者進(jìn)一步比較了兩種基因組表型之間脂質(zhì)代謝基因的差異，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)脂質(zhì)代謝基因顯著差異表達(dá)，前20個(gè)基因根據(jù)其p值按顯著性升序排列（圖 1K）。

LMS系統(tǒng)的外部驗(yàn)證

對(duì) 594 個(gè) DEGs 進(jìn)行單因素 Cox 分析，鑒定出 137 個(gè)與預(yù)后相關(guān)的基因。隨后，對(duì)這些基因進(jìn)行 PCA 以計(jì)算 LMS 系統(tǒng)，根據(jù)分?jǐn)?shù)的中位數(shù)將樣本分為高分組和低分組，高分組的 OS 時(shí)間顯著縮短（圖 2A）。1 、3 和 5 年的 AUC 分別為 0.694、 0.644和0.623，表明該評(píng)分提供了良好的表征。LMS 系統(tǒng)在驗(yàn)證集中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示 GSE72094數(shù)據(jù)集樣本在1 年、3 年和5 年的AUC分別為 0.696 、 0.671 和 0.774。 GSE42127 數(shù)據(jù)集樣本在 1 年、 3 年和 5 年的 AUC 分別為 0.891 和 0.774。GSE50081 數(shù)據(jù)集的 AUC 分別為 0.675、0.722 和 0.775，所有四個(gè)驗(yàn)證集都顯示出一致性（圖 2B-D）。多因素 Cox 分析顯示，LMS 仍然是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素 （圖 2E-H）。

基于脂質(zhì)代謝評(píng)分篩選潛在治療策略

作者檢查了 LMS 對(duì)免疫功能正常隊(duì)列中患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。雖然 GSE135222 的生存曲線未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但 GSE135222 和 IMvigor210 這兩個(gè)隊(duì)列都表現(xiàn)出與整個(gè)隊(duì)列的一致性，并且預(yù)后較差（圖 3A-F），表明可能與免疫治療反應(yīng)不佳有關(guān)。這些結(jié)果表明 LMS 可能在指導(dǎo)未來的臨床使用方面具有價(jià)值。為了預(yù)測(cè)訓(xùn)練集樣本的癌癥藥物敏感性基因組學(xué)（GDSC）數(shù)據(jù)庫(kù)藥物 IC50 值，作者在本研究中使用了 R 包 oncoPredict，通過將 GDSC 數(shù)據(jù)庫(kù)藥物信息與訓(xùn)練集的表達(dá)譜相結(jié)合，分析了 LMS 與每個(gè)藥物 IC50之間的 spearman 相關(guān)性，將 MK1775、多西他賽和 AZD7762 確定為具有顯著負(fù)相關(guān)的前三種藥物（p<0.05，圖 3G-H）。這些發(fā)現(xiàn)表明，這些藥物可能具有作為調(diào)節(jié)腫瘤脂質(zhì)代謝的抗腫瘤藥物的潛力。

MK1775 通過抑制腫瘤脂質(zhì)代謝和增強(qiáng)抗 PD-1 療效來抑制腫瘤增殖

與其他兩種藥物相比，MK1775 排名第一 （圖 3G）。在 MK1775 處理后觀察到油紅 O 染色最顯著的變化（圖 4A，B），表明 MK1775 和 LMS 之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性。于是作者在體外和體內(nèi)進(jìn)一步研究 MK1775。體外實(shí)驗(yàn)顯示，MK1775 上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面 PD-L1 的表達(dá)（圖 4C），表明與 PD-1 單克隆抗體的療效存在潛在關(guān)聯(lián)。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MK1775 與 PD-1 單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)腫瘤增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)（圖 4D，E），對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間的體重沒有顯著差異（圖 4F）。H&E 染色結(jié)果顯示 PD-1 單克隆抗體表現(xiàn)出一定的腎毒性，MK1775 處理減輕了這種毒性，且MK1775 未顯示出顯著的肝毒性或腎毒性（圖 4G）。MK1775 和 PD-1 單克隆抗體均有效抑制腫瘤中脂質(zhì)積累和 Ki67 表達(dá)，當(dāng)一起使用時(shí)，它們的抑制作用顯著增強(qiáng)。此外，免疫組化表明 MK1775 上調(diào)腫瘤中 PD-L1 的表達(dá)（圖 4H）。

MK1775 通過抑制腫瘤細(xì)胞中的 PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)來抑制腫瘤細(xì)胞和 TAM 之間的脂質(zhì)串?dāng)_

腫瘤組織多重免疫熒光結(jié)果顯示，MK1775 處理組腫瘤細(xì)胞和 TAMs 的數(shù)量顯著減少。與單藥組相比，PD-1 偶聯(lián)組的 TAM 數(shù)量沒有顯著差異，但腫瘤細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步減少（圖 5A）。為了研究 MK1775 是否促進(jìn)腫瘤和 TAMs 之間的脂質(zhì)串?dāng)_并增強(qiáng)抗 PD-1 單克隆抗體的療效，作者對(duì) MK1775 處理的 H1299 細(xì)胞進(jìn)行了脂質(zhì)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)MK1775 顯著下調(diào)脂質(zhì)，包括 FFA 、 TAG 、 24-OH-膽固醇和鞘磷脂 （圖 5B，C）。對(duì) MK1775 處理的 H1299 細(xì)胞進(jìn)行了 RNA 測(cè)序分析，下調(diào)的差異基因富集分析顯示，最富集的基因與 PI3K-AKT 信號(hào)通路有關(guān)（圖 5D，E）。Western blot 分析顯示，MK1775 抑制 PI3K 和下游 mTOR 的磷酸化活性，AKT 以及 FASN 的表達(dá)。此外，PI3K 激活劑能夠部分逆轉(zhuǎn) MK1775 的抑制作用（圖 5F）。

MK1775 通過下調(diào) PI3K/AKT/mTOR 通路介導(dǎo)的脂肪酸合成重塑 TME

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，MK1775 的腫瘤抑制作用被 Fasn 的過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)（圖 6A）。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，MK1775 顯著增加 CD8+ T 細(xì)胞水平，而 Fasn 過表達(dá)導(dǎo)致 CD8+ T 細(xì)胞顯著減少。MK1775 顯著降低 TAMs 的豐度，而 Fasn 的過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤中 TAM 積累的上調(diào)。MK1775 對(duì)細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 （CTL） 和 TAM 的影響可以被 Fasn 部分逆轉(zhuǎn)（圖 6B-D）。ELISA 測(cè)定表明，MK1775 顯著降低腫瘤中 CXCL10 、 CXCL11、IFN-γ 和 IL-2 的表達(dá)（圖 6E）。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步支持了 MK1775 促進(jìn) CD8+ T 細(xì)胞流入同時(shí)減少 TAM 的觀點(diǎn)（圖 6F）。

在體外實(shí)驗(yàn)中，使用 BODIPY-C11 標(biāo)記與用 MK1775 和/或過表達(dá) Fasn 處理的 LLC 細(xì)胞共培養(yǎng)的 M2 型巨噬細(xì)胞，觀察到 MK1775 抑制 TAM 中的脂肪酸氧化（FAO），但 Fasn 的過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了這種作用（圖 6G）。此外，MK1775 抑制線粒體氧化（OCR），同時(shí)提高 TAMs 的 FAO 水平。然而，這種效應(yīng)在 Fasn 過表達(dá)后部分逆轉(zhuǎn)（圖 6H）。體外 ELISA 測(cè)定表明MK1775 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中 CXCL10 和 CXCL11 的分泌，這種分泌被 PI3K 激活抑制，MK1775 逆轉(zhuǎn)了這種抑制（圖 6I）。qPCR和WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MK1775 促進(jìn) CXCL10 和 CXCL11 的轉(zhuǎn)錄因子 IRF1 的表達(dá)，但PI3K 激活抑制了 IRF1，但 MK1775 部分恢復(fù)了其表達(dá)（圖 6J，K）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明 MK1775 抑制 TAM 中的 FAO 并調(diào)節(jié) TME 中的免疫細(xì)胞組成。

研究總結(jié)

脂質(zhì)代謝重編程是癌癥的一個(gè)關(guān)鍵特征，該研究開發(fā)了一種 LMS 系統(tǒng)來準(zhǔn)確預(yù)測(cè) ICIs 的治療反應(yīng)，使用 LMS 系統(tǒng)，作者發(fā)現(xiàn) MK1775 有可能成為對(duì) PD-1 單藥治療無(wú)反應(yīng)或耐藥的患者進(jìn)行聯(lián)合治療的有效藥物，這項(xiàng)研究為利用脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)來提高癌癥免疫療法有效性的新策略提供了見解。