1. Author
James E. Crowe,Jr.實驗室研究重點是人類B細胞對病毒產(chǎn)生有效反應(yīng)的分子和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時，在生物防御研究、疫苗和單克隆抗體開發(fā)以及生物技術(shù)方面也有積極的項目。前的研究集中在埃博拉和馬爾堡病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流感、登革熱病毒、艾滋病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、輪狀病毒和諾如病毒、狂犬病、裂谷熱病毒、西尼羅河病毒和牛痘病毒/猴痘/天花。我們還對人類抗體對包括百日咳和金黃色葡萄球菌在內(nèi)的細菌毒素的反應(yīng)進行了新的研究。
James E. Crowe,Jr.團隊研究期間開發(fā)的許多候選疫苗和人類單克隆抗體已在I-III期人體臨床試驗中進行了測試，包括獲得EUA或美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局全面批準(zhǔn)的tixagevimab+cilgavimab（Evusheld），用于預(yù)防新冠肺炎，在美國、歐洲、中東、非洲和澳大利亞為患者提供了超過300萬次治療。
2. Background
2.1丙氨酸掃描突變
在分子生物學(xué)中，丙氨酸掃描是一種定點誘變技術(shù)，用于確定特定殘基對特定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或功能的貢獻。使用丙氨酸是因為它與其他氨基酸的二級結(jié)構(gòu)偏好相同，同時具有低體積、化學(xué)惰性的甲基官能團。當(dāng)需要保留突變殘基的大小時，有時會使用纈氨酸和亮氨酸。該技術(shù)還可用于確定特定殘基的側(cè)鏈?zhǔn)欠裨谏锘钚灾衅鹬匾饔谩ǔＭㄟ^定點誘變或通過創(chuàng)建 PCR 文庫隨機完成。此外，已經(jīng)開發(fā)出計算方法來根據(jù)丙氨酸取代估計熱力學(xué)參數(shù)。一項關(guān)于上皮鈉通道 (ENaC) 表面保守帶電殘基作用的系統(tǒng)研究使用丙氨酸掃描來揭示帶電殘基在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞表面的過程中的重要性。
3. Methods
1. 單克隆抗體的表達與純化
2. ELISA結(jié)合實驗
3. 血漿抗體競爭性結(jié)合實驗
4. 蝕斑減少中和試驗（FNRT）
5. 實時細胞分析中和實驗
6. 前/后接觸中和實驗
7. 接觸抑制實驗
8. 人源ACE2結(jié)合抑制實驗
9. 冷凍電鏡負染實驗
10. 丙氨酸掃描突變確定抗體結(jié)合表位圖譜
11. VSV構(gòu)建S突變株，確定逃逸位點
12. 肺部免疫組化
13. 小鼠保護實驗
4. Results
實驗團隊從新冠患者體內(nèi)得到了389株抗體，其中COV2-2676與COV2-2489為非RBD靶向，但具有一定中和能力的抗體。這兩個抗體與S6P存在著弱結(jié)合，但是與可溶性NTD不發(fā)生反應(yīng)。COV2-2263 和COV2-2490雖然沒有中和作用，但是與S6P和可溶性NTD都有一定的結(jié)合能力。后續(xù)利用了VSV假毒中和以及WT真毒實驗測定了這些抗體的中和能力。在表位競爭實驗中發(fā)現(xiàn)COV2-2676與COV2-2489的表位相同，并且與之前報道的NTD抗體都不相同。
因為COV2-2676與COV2-2489優(yōu)異的中和能力，將其確立為主要的研究對象，利用冷凍電鏡與負染的方法，探究兩個抗體具體的結(jié)合表位。發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合“關(guān)閉”狀態(tài)下的NTD段。有趣的是實驗團隊發(fā)現(xiàn)與之前中和能力可觀的抗體4A8和4-8相比，這些抗體的結(jié)合表位都包括了N3-N5 loop。后續(xù)利用丙氨酸掃描技術(shù)，確定了NTD中A123, G142, Y144, F157和N164為關(guān)鍵結(jié)合表位；VSV突變逃逸實驗確定了NTD中F140S,G142D,R158S為關(guān)鍵的中和表位。
眾所周知，NTD的抗體可以與已被感染的細胞結(jié)合進而清除病原體。實驗團隊利用流式細胞術(shù)的方法，來測定COV2-2676與COV2-2489與感染細胞的結(jié)合能力。實驗發(fā)現(xiàn)雖然在絕對數(shù)值方面，COV2-2676與COV2-2489不如RBD抗體，但是就結(jié)合效率遠高于RBD抗體。同時COV2-2676與COV2-2489的結(jié)合表現(xiàn)出細胞類型依賴性，對VeroE6的親和力最好。除此之外實驗團隊還發(fā)現(xiàn)，單純的Fab段的COV2-2676與COV2-2489不能夠發(fā)揮中和效應(yīng)，具體的機制尚不清楚，實驗團隊推測可能是需要Fc的空間效應(yīng)才能夠發(fā)揮中和的作用。
在個體水平進行的小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，無論是預(yù)防還是治療，COV2-2676與COV2-2489都擁有良好的保護功能。后續(xù)的Fc功能驗證實驗也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RBD與NTD抗體連用時，保護效果更佳。
5. Discussion
作者： Naveenchandra Suryadevara
通訊作者：James E. Crowe, Jr.
單位：Vanderbilt Vaccine Center, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA
年份：2021.4.29
期刊：Cell
科學(xué)問題 ：非RBD靶向的抗體（NTD）發(fā)揮功能的方式是什么
結(jié)論：實驗團隊通過血清學(xué)與分子生物學(xué)等手段分離鑒定了有別于4A8/4-8的NTD抗體——COV2-2676和COV2-2489。這兩個NTD抗體通過抑制感染的post-attachment階段進而阻止病毒的進入與融合。同時，COV2-2676和COV2-2489的Fab 形式失去了中和活性，這可能表明阻斷是通過 Fc 段向 RBD 方向投射的空間效應(yīng)間接發(fā)生的（MERS-CoV mAB 7D10 的情況一樣）。后續(xù)通過丙氨酸掃描手段，確定了NTD的關(guān)鍵中和部位：F140S/G142D/R158S。實驗團隊同時還提出這類抗體可能還通過Fc段效應(yīng)功能來幫助機體抵御病毒侵襲。這為疫苗設(shè)計提供了新思路：RBD+NTD的新模式。
