問題1：使用snippy用于fasta序列的文件SNP calling。發(fā)現(xiàn)結果中core.full.aln中，有開頭100bp和結尾的100bp被標記為NN

>JN580301
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTCACTCCTTGGCGCCTGC
CTGATCCTCCAAATCACCACAGGACTATTCCTAGCCATGCACTACTCACCAGACGCCTCA
ACCGCCTTTTCATCAATCGCCCACATCACTCGAGACGTAAATTATGGCTGAATCATCCGC
TACCTTCACGCCAATGGCGCCTCAATATTCTTTATCTGCCTCTTCCTACACATCGGGCGA
GGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACTCAGAAACCTGAAACATCGGCATcATCCTCCTG
CTTGCAACTATAGCAACAGCCTTCATAGGCTATGTCCTCCCGTGAGGCCAAATATCATTC
TGAGGGGCCACAGTAATTACAAACTTACTATCCGCCATCCCATACATTGGGACAGACCTA
GTTCAATGAATCTGAGGAGGCTACTCAGTAGACAGTCCCACCCTCACACGATTCTTTACC
TTTCACTTCATCTTGCCCTTCATTATTGCAGCCCTAGCAgCACTCCACCTCCTATTCTTG
CACGAAACGGGATCAAACAACCCCCTAGGAATCACCTCCCATTCCGATAAAATCACCTTC
CACCCTTACTACACAATCAAAGACGCCCTCGGCTTACTTCTCTTCCTTCTCTCCTTAATG
ACATTAACACTATTCTCACCAGACCTCCTAGGCGACCCAGACAATTATACCCTAGCCAAC
CCCTTAAACACCCCTCCCCACATCAAGCCCGAATGATATTTCCTATTCGCCTACACAATT
CTCCGATCCGTCCCTAACAAACTAGGAGGCGTCCTTGCCCTATTACTATCCATCCTCATC
CTAGCAATAATCCCCATCCTCCATATATCCAAACAACAAAGCATAATATTTCGCCCACTA
AGCCAATCACTTTATTGACTCCTAGCCGCAGACCTCCTCATTCTAACCTGAATCGGAGGA
CAACCAGTAAGCTACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-----

查看snippy github的操作說明是和--mincov這個參數(shù)有關，--mincov N Minimum site depth to for calling alleles (default '10')
想著是不是調整為 --mincov 1 就可以避免前后100bp被替換成N。

• mincov=1
  [23:09:25] Wrote 14 fake 250bp reads (2x, stride 250bp) to fake_reads.fq
  此時無SNP識別出，序列頭尾沒有替換成N

• mincov=2
  [06:10:29] Wrote 28 fake 250bp reads (4x, stride 125bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出，且序列頭尾沒有替換成N

• mincov=3
  [06:40:16] Wrote 40 fake 250bp reads (6x, stride 83.3333333333333bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有51bp替換成N

• mincov=4
  [06:50:21] Wrote 54 fake 250bp reads (8x, stride 62.5bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有61bp替換成N

• mincov=5
  [18:40:59] Wrote 66 fake 250bp reads (10x, stride 50bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有85bp替換成N

• mincov=6
  [19:09:08] Wrote 80 fake 250bp reads (12x, stride 41.6666666666667bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有83bp替換成N

• mincov=7
  [19:36:36] Wrote 92 fake 250bp reads (14x, stride 35.7142857142857bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有100bp替換成N

• mincov=8
  [21:54:21] Wrote 106 fake 250bp reads (16x, stride 31.25bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有93bp替換成N

• mincov=9
  [22:06:31] Wrote 118 fake 250bp reads (18x, stride 27.7777777777778bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有108bp替換成N

• mincov=10 也是程序默認的參數(shù)
  [23:17:21] Wrote 132 fake 250bp reads (20x, stride 25bp) to fake_reads.fq
  此時有SNP識別出（同2），且序列頭尾有100bp替換成N

嘗試了多個mincov，在使用fasta序列進行SNP calling時，參數(shù)不同，最后生成的比對序列被替換的N也不同。沒有深究程序里思維，從表面看即使是使用組裝好的fasta基因組序列或contig，在SNP calling的過程中是先生成fake_reads.fq（250bp，單端），然后基于此fastq序列進行calling。運行結束又刪除了此文件。
在--mincov 2 時，開頭和結尾沒有N替換，不知道是我此次的序列數(shù)據的特例還是都是如此，需要多次實踐去嘗試了。

問題2：在有差異度比較大的序列存在時，容易出現(xiàn)SNP找不出來的狀況。比如一個物種有些特異序列，另一個物種里無特異序列，則這些特異序列就會被忽略掉，會造成最后的core SNP位點特別少。所以snippy看起來僅適合近源物種的SNP calling。

問題3：若一組基因序列中，有1條序列中有連續(xù)的若干個N存在，則此位點在合并后的序列中被去除，容易造成假的序列保守性的推論。故需要在做SNP calling時確保序列為高質量序列。比如測序基因組，若有明顯測序覆蓋度低的基因組，須在SNP calling前剔除。

這幾個問題是在有限的幾次嘗試中發(fā)現(xiàn)的。是不是真實如此，且解釋是否合適還需進一步探索，也歡迎各位同行留言討論~~~~