1，ORF簡(jiǎn)介
開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）從起始密碼子開始，到終止密碼子結(jié)束的連續(xù)堿基序列，具有蛋白質(zhì)編碼潛能。由于密碼子（codon）讀寫起始位點(diǎn)的不同，mRNA序列可能按照6種ORF閱讀和翻譯。如圖1所示，對(duì)于序列1，可以從A開始讀，也可以從T開始讀，也可以從G開始讀，因此一條序列上就有3種讀碼方式。同樣的，互補(bǔ)鏈上也有3種，共6種ORF閱讀方式。理論上，6種讀碼框都有“開放”的可能，但是現(xiàn)實(shí)世界中，生物體一般會(huì)使用不多于2個(gè)“開放讀碼框”。
圖1. 6種讀碼框示意圖
2，NCBI ORFfinder
ORF識(shí)別是確定哪種開放閱讀框?qū)?yīng)真正的多肽編碼序列的過(guò)程。NCBI ORFfinder為最常用的ORF預(yù)測(cè)在線工具，使用也非常簡(jiǎn)單。
2.1，打開NCBI ORFfinder網(wǎng)站
在瀏覽器中輸入網(wǎng)站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/
圖2. NCBI ORFfinder
2.2，粘貼序列并選擇參數(shù)
Fasta格式文件是存儲(chǔ)核酸或者蛋白質(zhì)序列的一種標(biāo)準(zhǔn)格式。是以大于號(hào)“>”開頭，后邊接序列名字為第一行，其余行為序列的一種標(biāo)準(zhǔn)序列存儲(chǔ)文件格式。如圖所示：
圖3. Fasta格式序列
這個(gè)文件中包含兩條序列，一條是seq1，一條是seq2。
進(jìn)行ORFfinder預(yù)測(cè)時(shí)，我們要將fasta格式的序列拷貝粘貼到輸入框中（一次一條）。
這里我們粘貼來(lái)自lncipedia（https://lncipedia.org/，lncRNA百科全書網(wǎng)站）的一條lncRNA序列PITPNM2-AS1:6進(jìn)行預(yù)測(cè)。然后選擇參數(shù)（一般默認(rèn)）。最后點(diǎn)擊提交按鈕，等候幾秒鐘后會(huì)出現(xiàn)結(jié)果。
圖4. NCBI ORFfinder序列提交及參數(shù)選擇
2.3，結(jié)果查看
結(jié)果包括：
1，預(yù)測(cè)的ORFs
2，6種讀碼框（需要點(diǎn)擊Six-frame translation處按鈕才顯示）
3，每個(gè)預(yù)測(cè)的ORF所處的讀碼框、坐標(biāo)及長(zhǎng)度（核苷酸|氨基酸），可以下載查看具體核酸序列及氨基酸序列等
4，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，可以進(jìn)行blast等操作
圖5. NCBI ORFfinder結(jié)果
然而，相較于舊版ORFfinder（圖5），新版NCBI ORFfinder的結(jié)果不好在論文中展示?？鄬o(wú)果后，我們參考文獻(xiàn)中舊版ORFfinder的樣式，開發(fā)了在線ORFfinder結(jié)果可視化功能。
圖6. 舊版NCBI ORFfinder結(jié)果
3，ORFfinder在線可視化（仿舊版）
3.1，打開繪圖頁(yè)面
微生信-在線NCBI ORFfinder結(jié)果可視化 (bioinformatics.com.cn)
圖7. ORFfinder可視化頁(yè)面
3.2，拷貝示例數(shù)據(jù)
下載示例數(shù)據(jù)，該模塊的輸入為第一個(gè)sheet的內(nèi)容。
（可以將第2個(gè)sheet的序列提交到NCBI ORFfinder，默認(rèn)參數(shù)，獲得sheet1的內(nèi)容）。
圖8. 輸入數(shù)據(jù)示例
第一列為ORF的名字（label），第二列為鏈（Strand），第三列為讀碼框編號(hào)（Frame），第4、5列為ORF的起始和終止坐標(biāo)，第6列為長(zhǎng)度，包括核酸和蛋白的長(zhǎng)度。
3.3，粘貼示例數(shù)據(jù)
必需輸入包括兩個(gè)：1，orffinder的結(jié)果，2，序列總長(zhǎng)度（可由NCBI ORFfinder結(jié)果中查到）
圖9. 必需輸入
3.4，修改參數(shù)，并提交
圖10. 顏色等參數(shù)
開放了圖片尺寸，ORF顏色，最長(zhǎng)ORF顏色等參數(shù)，以滿足不同的繪圖需求。
3.5，提交出圖
結(jié)交約3秒后，在頁(yè)面右側(cè)出現(xiàn)結(jié)果預(yù)覽圖，其中最長(zhǎng)ORF用紫紅色標(biāo)注。我們提供了4種圖片格式供下載使用，兩種矢量圖（pdf，svg）和兩種標(biāo)量圖（600 dpi tiff和300 dpi png）。
圖11. 仿ORFfinder舊版可視化結(jié)果
注意：舊版中坐標(biāo)小的在左側(cè)，大的在右側(cè)，跟新版略有不同。這里使用的左側(cè)小，右側(cè)大的排序方式。
沒(méi)有預(yù)覽就是沒(méi)有出圖，這時(shí)請(qǐng)參考示例數(shù)據(jù)，檢查輸入數(shù)據(jù)格式！
遇到文字截?cái)?，需要修改字體、調(diào)整字體大小等，使用scape 軟件。
