流式圖有很多種，最常用的是流式直方圖和流式散點(diǎn)圖，還有流式等高線圖。流式直方圖只能顯示一個(gè)通道的信息，流式散點(diǎn)圖和流式等高線圖可以同時(shí)顯示2個(gè)通道的信息。
流式通道
流式通道主要可以分為散射光通道和熒光通道：散射光通道有兩個(gè)，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式細(xì)胞儀均有這2個(gè)散射光通道；不同型號的流式細(xì)胞儀其熒光通道的多少差異較大，有的甚至沒有光通道。
FSC，即前向角散射，它的值代表細(xì)胞的大小。細(xì)胞體積越大，其FSC值就越大。所以可以利用細(xì)胞的FSC值初步比較細(xì)胞的大小，利用FSC值對細(xì)胞進(jìn)行分群和分類。SSC，即側(cè)向角散射，它的值代表細(xì)胞的顆粒度（granularity）。細(xì)胞越不規(guī)則，細(xì)胞表面的突起越多，細(xì)胞內(nèi)能夠引起激光散射的細(xì)胞器或者顆粒性物質(zhì)越多，其SSC值就越大。所以可以利用細(xì)胞的SSC值初步比較細(xì)胞的顆粒度，利用SSC值對細(xì)胞進(jìn)行分群和分類。
一般在硏究細(xì)胞樣品時(shí)，首先關(guān)注的就是樣品中細(xì)胞的FSC-SSC散點(diǎn)圖，x軸代表FSC值，y軸代表SSC值，將細(xì)胞都顯示于該散點(diǎn)圖中，可以初步根據(jù)細(xì)胞的大小和顆粒度對細(xì)胞進(jìn)行分群和分類。樣品細(xì)胞不需要標(biāo)記任何熒光素偶聯(lián)抗體，直接上樣分析就可以得到樣品細(xì)胞的FSC值和SSC值，其值代表的是細(xì)胞的大小和顆粒度這兩個(gè)基本的物理特征，所以樣品的FSC-SSC散點(diǎn)圖又稱為樣品細(xì)胞的 “物理圖”。
熒光通道表示的不是細(xì)胞特有的物理特征，而是其化學(xué)特征。如需要檢測樣品中是否有細(xì)胞表達(dá)某一CD分子，則需要標(biāo)記熒光素偶聯(lián)的該CD分子的抗體，表達(dá)有該CD分子的細(xì)胞就會結(jié)合熒光素偶聯(lián)抗的該CD分子的抗體，表達(dá)有該CD分子的細(xì)胞就會結(jié)合熒光素偶聯(lián)抗體，其中的熒光素被相應(yīng)的激光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，該熒光信號通過光路系統(tǒng)被相應(yīng)的熒光通道接收，就能得到該樣品中是否有細(xì)胞表達(dá)該CD分子，以及有多少比例的細(xì)胞表達(dá)該CD分子等信息。熒光通道接收到的信號越強(qiáng)，表示細(xì)胞上結(jié)合的熒光素越多，那么細(xì)胞表面表達(dá)的該CD分子就越多，因此可根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱判斷細(xì)胞表達(dá)該CD分子的相對數(shù)量。總之，熒光通道值反映接收到的熒光信號的強(qiáng)弱，從而反映細(xì)胞上結(jié)合的熒光素的量，進(jìn)一步反映細(xì)胞上表達(dá)該CD分子的量，最后間接反映細(xì)胞表達(dá)某CD分子這一化學(xué)特征。
不同細(xì)胞群的FSC值和SSC值最多相差幾倍，而熒光信號強(qiáng)弱之間一般相差很大，陰性細(xì)胞與陽性細(xì)胞之間、強(qiáng)陽性與弱陽性之間有時(shí)可以相差幾十倍、幾百倍，甚至幾千倍，呈指數(shù)關(guān)系。所以，流式圖數(shù)軸上FSC值和SsC值以“一般數(shù)序形式”表示，而熒光通道值常以“對數(shù)形式”（logarithmic scale）表示，在識圖時(shí)需要注意數(shù)軸的表示形式。當(dāng)然，并不是所有的熒光通道值都以“對數(shù)形式”表示，當(dāng)熒光信號值相差不多時(shí)，也可以“一般數(shù)序形式”表示，如P染色檢測細(xì)胞內(nèi)DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分選側(cè)群干細(xì)胞時(shí)，均以“一般數(shù)序形式”表示。
流式直方圖
流式直方圖形成的原理與統(tǒng)計(jì)學(xué)中的直方圖相似,是在統(tǒng)計(jì)學(xué)直方圖的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展而成的。流式直方圖的x軸表示一個(gè)通道的值,y軸表示細(xì)胞數(shù)量。
流式直方圖雖不是如此簡單，但是基本原理是相同的。流式直方圖是在此統(tǒng)計(jì)直方圖的基礎(chǔ)上，使統(tǒng)計(jì)區(qū)間不斷地縮小，縮小到甚至可以認(rèn)為一個(gè)值就是一個(gè)統(tǒng)計(jì)區(qū)間，使統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)量不斷地增加，增加到以萬計(jì)，甚至以十萬計(jì)時(shí)，相鄰的小統(tǒng)計(jì)區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞數(shù)相差不多，這時(shí)的直方圖好像是由光滑的曲線所圍成的。其實(shí)，這只是直方圖統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)達(dá)到一定量時(shí)視覺上的一個(gè)假象，這個(gè)由光滑的曲線圍成的流式直方圖實(shí)際上是由無數(shù)個(gè)非常小的統(tǒng)計(jì)區(qū)間組成的為了方便理解，可以認(rèn)為x軸上的一個(gè)點(diǎn)就是一個(gè)統(tǒng)計(jì)區(qū)間，而曲線上該點(diǎn)對應(yīng)的y軸值就是x軸代表的通道的熒光信號值對應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。這時(shí)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞群體比例時(shí)可以通過計(jì)算曲線下所圍的面積的比例來表示。
綜上所述，流式直方圖本質(zhì)上就是統(tǒng)計(jì)直方圖，是累積顯示細(xì)胞量非常大而統(tǒng)計(jì)區(qū)間又非常小的統(tǒng)計(jì)直方圖。
流式散點(diǎn)圖
流式直方圖只能表示一個(gè)通道的信息，而流式散點(diǎn)圖能夠同時(shí)表示兩個(gè)通道的信息。流式散點(diǎn)圖也是采取坐標(biāo)軸的方式，x軸表示一個(gè)通道的值，y軸表示另一個(gè)通道的值，圖中每一點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，該點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)值就是該點(diǎn)所代表細(xì)胞的x軸通道的值，所對應(yīng)的縱坐標(biāo)值就是該點(diǎn)所代表細(xì)胞的y軸通道的值。
與流式直方圖相比，流式散點(diǎn)圖能夠同時(shí)表示兩個(gè)通道的值，能夠更加直觀地表示細(xì)胞的信息，所以流式散點(diǎn)圖更加直觀和常用。雖然，兩張流式直方圖也可以表示兩個(gè)通道的信息，但是兩張流式直方圖不能表示細(xì)胞這兩個(gè)通道值之間的相互關(guān)系，如不能直觀地表示其中一個(gè)通道值低的細(xì)胞其另一個(gè)通道值是高還是低，而在流式散點(diǎn)圖中卻可以非常直觀地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群體中這兩個(gè)通道值的相互高低關(guān)系，從而更易于細(xì)胞分群、分類，以及確定比例關(guān)系等。
下圖所示的是某正常人外周血白細(xì)胞FSC－SSC散點(diǎn)圖。FSC代表細(xì)胞的大小，SSC代表細(xì)胞的顆粒度，從圖中可以看出，根據(jù)細(xì)胞的大小和顆粒度，正常人外周血白細(xì)胞可以分為3群。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：小細(xì)胞、小顆粒度的紅色細(xì)胞群是淋巴細(xì)胞群，T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞都位于此淋巴細(xì)胞群；中細(xì)胞、中顆粒度的綠色細(xì)胞群是單核細(xì)胞群大細(xì)胞、大顆粒度的黃色細(xì)胞群是中性粒細(xì)胞群。
一般在流式分析過程中，先利用FSC-SC物理圖根據(jù)細(xì)胞的大小和顆粒度將細(xì)胞進(jìn)行分群，然后根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞處于哪個(gè)群體，再將該群體細(xì)胞設(shè)門（setgate），進(jìn)一步分析該群體中的目標(biāo)細(xì)胞。
門（gate）是流式分析過程中一個(gè)較為重要的概念，流式分析時(shí)有時(shí)不希望所有的樣品細(xì)胞都顯示于流式圖中，而是希望只顯示感興趣的細(xì)胞，排除其他非相關(guān)細(xì)胞的干擾，使顯示的信息更加直觀，更具有針對性。例如，分析CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例時(shí)，樣品細(xì)胞是小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，此時(shí)可以根據(jù)CD4的表達(dá)情況，將CD4+T細(xì)胞設(shè)門顯示于一個(gè)新的流式圖中，則該流式圖只顯示所設(shè)門內(nèi)的細(xì)胞，即只顯示CD4+T細(xì)胞，其他無關(guān)細(xì)胞不會被顯示。在相應(yīng)散點(diǎn)圖中x軸代表CD4信息，軸代表CD25信息，這樣就可以非常直觀地計(jì)算出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。
下圖所示的是正常C57小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞分群的流式散點(diǎn)圖。
圖A是所有脾臟單個(gè)核細(xì)胞的FSC-SSC散點(diǎn)圖，設(shè)門淋巴細(xì)胞群顯示于圖B和圖D所示的散點(diǎn)圖中。圖B所示的是脾臟淋巴細(xì)胞的CD3-CD19散點(diǎn)圖，從圖中可以看出，脾臟淋巴細(xì)胞主要包括CD3+CD19-T淋巴細(xì)胞和CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞兩群細(xì)胞，分別占總淋巴細(xì)胞的36.4％和58.3％，牌臟中的B細(xì)胞要多于T細(xì)胞。圖C所示的是將圖B中的B細(xì)胞設(shè)門后顯示的CD19-CD5散點(diǎn)圖，CD5+B1 B細(xì)胞占所有脾臟B細(xì)胞的7.5％，說明小鼠脾臟中的B細(xì)胞絕大多數(shù)是經(jīng)典的CD5-B2B細(xì)胞。圖D所示的是脾臟淋巴細(xì)胞的CD3-NK1.1散點(diǎn)圖，主要可以分為CD3+NK1.1-T細(xì)胞、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞和CD3-NK1.1-B淋巴細(xì)胞，脾臟淋巴細(xì)胞中的NK細(xì)胞比例較低，只占3.5％。圖E所示的是將圖B中的T細(xì)胞設(shè)門后顯示的CD4-CD8散點(diǎn)圖，從圖中可以看出，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分別占55.6％和40.2％，脾臟中的T細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞為主。圖F所示的是將圖E中的CD4+T細(xì)胞設(shè)門后顯示的CD4-CD25散點(diǎn)圖，CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占所有CD4T細(xì)胞的15.8％，說明在正常情況下牌臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例較低。
通過對以上流式散點(diǎn)圖的分析，讓我們對正常小鼠牌臟淋巴細(xì)胞分群有了大致的了解。從這個(gè)實(shí)例也可以看出，流式散點(diǎn)圖比流式直方圖顯示更多的信息。
流式等高線圖
流式等高線圖與流式散點(diǎn)圖相似，一張流式等高線圖也能同時(shí)顯示兩個(gè)通道的信息，所不同的是，它借助地理等高線圖的形式。地理等高線圖用封閉的環(huán)線代表海拔高度相同的地方，環(huán)線聚集越多，表示海拔高度變化越快，環(huán)線的中央?yún)^(qū)域表示海拔最高或者最低的區(qū)域。流式等高線圖借助地理等高線圖表示細(xì)胞的密集程度，流式等高線圖的環(huán)線代表的是細(xì)胞密度相同的區(qū)域，所以，環(huán)線聚集越多的地方表示此區(qū)域細(xì)胞密度變化越快，細(xì)胞最稀疏的地方還是用散點(diǎn)表示，環(huán)線的中央?yún)^(qū)域代表細(xì)胞聚集的中心。
流式等高線圖的意義和實(shí)際應(yīng)用與流式散點(diǎn)圖較為相似，可以看作是流式散點(diǎn)圖的一個(gè)變體。相比之下，流式散點(diǎn)圖更為直觀，所以應(yīng)用也更為廣泛。當(dāng)然，流式等高線圖也有其自身的優(yōu)點(diǎn)，它較能直觀地體現(xiàn)細(xì)胞群的集中點(diǎn)，等密度環(huán)線的中央?yún)^(qū)域代表一個(gè)細(xì)胞群的集中點(diǎn)，一般代表一個(gè)細(xì)胞群，所以在某些情況下，流式等高線圖比流式散點(diǎn)圖更能直觀地體現(xiàn)細(xì)胞的分群。
下圖顯示的是正常C57小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分群的流式等高線圖。
