本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的Folin-酚試劑為北京某某昌盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，效果尚可，該公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量試劑盒比Folin-酚試劑檢測(cè)更精確，且不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，對(duì)于蛋白純化樣本含量測(cè)定來(lái)說(shuō)更加適合。
1、Folin-酚法（Lowry法）原理：
? 這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。
2、技術(shù)指標(biāo)：
? 本試劑盒可測(cè)定蛋白濃度0.05--1mg/ml。當(dāng)?shù)鞍诐舛确秶?.05-0.5mg/ml范圍時(shí)，線性關(guān)系最好。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)：R2大于0.99.
3、試劑盒組分：
?1.Folin—酚試劑甲
溶液I：2g無(wú)水碳酸鈉和20mg酒石酸鈉溶于100ml 0.2mol/l氫氧化鈉中（已配制成5×，用時(shí)稀釋5倍，使用完需另配)。
溶液Ⅱ：0.5g五水硫酸銅溶于100ml水溶液。
將稀釋后的溶液I與溶液Ⅱ，以50：1的比例混合，混合后即為Folin—酚試劑甲，此試劑只能用一天，過(guò)期失效。
? 2.Folin—酚試劑乙
原液濃度為2moL/L使用前需稀釋一倍，用多少稀釋多少。使其最后濃度為1moL/L。此為Folin—酚試劑乙應(yīng)用液。Folin—酚試劑乙原液平時(shí)應(yīng)密封貯存于4℃冰箱中避光保存。
4、操作方法：
? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
? 取14支試管分成兩組，按下表順序加入試劑，混勻，于室溫放置10分鐘。再加入0.5毫升試劑乙，立即搖勻，在室溫放置30分鐘，然后于500nm處比色。測(cè)定光密度值。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，光密度值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為定量的依據(jù)。
試劑/管號(hào)0123456
BSA/ml(250ug/ml00.10.20.40.60.81.0
蒸餾水/ml1.00.90.80.60.40.20
試劑甲/ml5555555
試劑乙/ml0.50.50.50.50.50.50.5
樣品測(cè)定：
（1）取1毫升樣品溶液（約含20-250微克多肽或蛋白質(zhì)）加入5毫升試劑甲混勻，于室溫放置10分鐘。
（2）加入0.5毫升試劑乙（folin—酚），立即搖勻，于室溫保溫30分鐘；然后500nm（根據(jù)使用情況）處比色，以1毫升水代替樣品作空白對(duì)照。測(cè)定后，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出未知樣品濃度。
? 若用0.5厘米光程的比色杯進(jìn)行比色，可按下面方法進(jìn)行操作：取0.2毫升樣品溶液（約含5-100微克多肽或蛋白質(zhì)），加入1毫升試劑甲（可選用0.3-0.5厘米直徑的小試管）混勻，10分鐘以后，再加入0.1毫升試劑乙，立即混勻，30分鐘后比色，一般來(lái)說(shuō)，若多肽或蛋白質(zhì)濃度在2-25微克，則采用波長(zhǎng)755nm,而25微克以上則采用500nm比色為宜（波長(zhǎng)選擇依使用情況）。
樣本1樣本2樣本3
試劑/管號(hào)0123456789
BSA/ml(250ug/ml)或樣本00.020.040.080.120.160.20.20.20.2
蒸餾水/ml0.20.180.160.120.080.040000
試劑甲/ml1111111111
試劑乙/ml0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1
測(cè)值1
測(cè)值2
計(jì)算Pr=
紫外分光光度計(jì)測(cè)Pr=
500nm波長(zhǎng)
