In-Fusion無縫克隆的原理：基于插入片段和線性化載體末端15-20 bp的同源序列進行同源重組從而實現克隆的方法。

ClonExpress技術是一種簡單、快速并且高效的 DNA 無縫克隆技術，可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點。 ClonExpress?II 是新一代重組克隆試劑盒，包含增強的重組酶 Exnase?II。使用任意方式將載體進行線性化；在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引入線性化載體的末端序列，使得 PCR 產物 5’ 和 3’ 最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的 PCR 產物和線性化載體按一定比例混合后，在Exnase?II 重組酶的催化下，僅需反應 30 min 即可進行轉化，完成定向克隆，陽性率可達 95% 以上。

一、無縫克隆實驗步驟

⑴ 線性化載體的制備
通過限制性核酸內切酶酶切載體使其線性化。
⑵ 插入片段的獲得：
將線性化載體末端15 - 20 bp序列作為同源序列(藍色和紅色標記)，并將其分別添加到基因特異性正/反向擴增引物序列的5’端，以此對引物擴增得到帶有同源序列的插入片段。
⑶ 重組反應：
將線性化載體和插入片段按比例混合，在重組酶Exnase 催化下，37℃反應30min即可完成重組反應，實現兩線性化DNA的體外環(huán)化。
⑷ 轉化感受態(tài)細胞：
重組產物直接進行轉化，平板上會形成數百個單克隆供后期陽性篩選。

二、無縫克隆實驗的示意圖

基因敲除載體的構建流程.png

同源重組原理.png

思維導圖.png

Reference:
C112 CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit