首先聲明，作為大學(xué)時(shí)的生物狗和工作時(shí)的挨踢狗，實(shí)非基因測(cè)序的專業(yè)人士。
再說(shuō)說(shuō)寫這篇文章的緣由，華大基因的BGISEQ-500?，自從15年10月發(fā)布會(huì)以來(lái)，就鮮有報(bào)道，但作為一款身負(fù)基因測(cè)序平民化重任的產(chǎn)品，卻十分吸引我的眼球。最近心血來(lái)潮，打算給自己做個(gè)全基因組測(cè)序，看了下現(xiàn)有的服務(wù)報(bào)價(jià)，近4萬(wàn)元的價(jià)格，艾瑪，看不下去了，于是就想起了半年前這款號(hào)稱平民的產(chǎn)品，卻在公開信息中始終查不到價(jià)格，回看發(fā)布會(huì)中價(jià)格比同類產(chǎn)品低1/3的宣傳，首先想到illumia的HiSeq 2500，這個(gè)價(jià)格好查，74萬(wàn)美元，艾瑪，看不下去了，后來(lái)發(fā)現(xiàn)選錯(cuò)對(duì)象了，NexSeq 500無(wú)論從名字還是定位上才是BGISEQ-500的對(duì)標(biāo)，35萬(wàn)美元的價(jià)格，砍掉1/3也是100多萬(wàn)軟妹幣啊，艾瑪，買不起總能看看吧，原理先要搞清楚，說(shuō)不定哪天就買得起了，于是在seq500官網(wǎng)查到以下信息：
視頻看不懂沒(méi)關(guān)系，一開始我也沒(méi)看懂，于是才有了這篇文章。
總結(jié)視頻中基因測(cè)序的步驟?：
1. DNA提取與分段
準(zhǔn)備樣本 -> DNA提取 -> DNA分段 -> DNA片段末端修復(fù) ->
2. DNA片段擴(kuò)增（納米球技術(shù)）
加接頭序列 -> 分離出單股DNA -> 成環(huán) -> 滾環(huán)擴(kuò)增 -> 形成DNA納米球
3. DNA序列識(shí)別
DNA納米球附著芯片 -> 組合探針錨定連接法測(cè)序
4. 分析
堿基讀取 -> 數(shù)據(jù)比對(duì)和組裝 -> 基因組 -> 結(jié)果分析
文字也看不懂？那只能聽我瞎掰了，哈哈
拋開細(xì)節(jié)，只看做了什么和為什么這么做，準(zhǔn)備樣本和DNA提取不用說(shuō)了，干活總要把家伙先掏出來(lái)吧，為什么要分段，讓你看100萬(wàn)字的書不可能一氣兒看完，30億個(gè)堿基對(duì)也要分開來(lái)讀，而且堿基那么小，處理和讀取時(shí)丟失和讀錯(cuò)的可能性很大，于是就要多讀幾遍，反復(fù)驗(yàn)證，方法就是把書拆成一頁(yè)一頁(yè)，每頁(yè)都復(fù)制個(gè)上百遍，裝訂成小冊(cè)子（納米球），那么為什么還要末端修復(fù)，因?yàn)槟悴饡臅r(shí)候總有不小心撕壞書角，丟失了文字，那丟了還怎么修復(fù)，因?yàn)镈NA特殊啊，自帶備份，著名的雙螺旋結(jié)構(gòu)就是一份信息，兩份拷貝，只要另一份拷貝還在，就能根據(jù)它還原缺失的書角，后面的加接頭序列、分離出單股DNA、成環(huán)、滾環(huán)擴(kuò)增都跟DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)，加接頭就是復(fù)制書頁(yè)前標(biāo)識(shí)書頁(yè)的開頭結(jié)尾，以便復(fù)制后仍能準(zhǔn)確地區(qū)分拷貝，既然要大規(guī)模復(fù)制了，只需要一份拷貝就可以了，于是就分離出單股DNA，成環(huán)是方便之后的滾環(huán)擴(kuò)增，DNA成了環(huán)形，就能讓DNA聚合酶繞著環(huán)不停地轉(zhuǎn)圈，復(fù)制出的上百份拷貝都在一股新DNA上，就像一股毛線卷成了毛線團(tuán)一樣，最后成了納米球（DNB, DNA Nano Ball）。
完成了書的復(fù)制，接下來(lái)就要讀書了，這里還需要兩樣關(guān)鍵東西，書桌和眼睛，芯片就是書桌， 問(wèn)題來(lái)了，書已經(jīng)拆成一頁(yè)一頁(yè)了，復(fù)制后每一頁(yè)都是一本書，這么多書都放桌上？對(duì)的，書不僅都要放上，而且都要攤開固定，一本一本擺得整整齊齊，這就需要芯片上有整齊的固定點(diǎn)，讓納米球自動(dòng)附著上去，且不會(huì)堆疊，這個(gè)就是陣列技術(shù)（Pattern Array）。而眼睛是讀書的核心，雖然是一個(gè)詞，卻是一整套技術(shù)，先把術(shù)語(yǔ)拋出來(lái)，回頭我整明白了再慢慢解釋，哈哈，組合探針錨定連接法（cPAS）。
而最關(guān)鍵的分析，就是你還得有個(gè)腦子去讀懂內(nèi)容，這里跟普通讀書最重要的區(qū)別，除了要讀n多遍重復(fù)的內(nèi)容之外，你還不是按順序讀的，書沒(méi)有頁(yè)碼，在拆書的過(guò)程中，頁(yè)的順序也被打亂了，你現(xiàn)在只有拼圖的一些碎片，而任務(wù)是先要把讀到的片段拼成一本書，好在這些片段都有一些線索，它們會(huì)有重疊的部分，至于為什么會(huì)有重疊的部分，我還沒(méi)搞清楚，而這些重疊信息讓你能像拼圖一樣把片段拼接起來(lái)，至于會(huì)不會(huì)有兩個(gè)長(zhǎng)得像的片段被放錯(cuò)了地方，我還沒(méi)搞清楚，最后的結(jié)果是你得到了基因組，還原了這本書，至于你是否讀得懂，那又是另一回事，就像一句名言所說(shuō)，你認(rèn)得書中的每一個(gè)字母，但就是不知道這本書在說(shuō)什么，后基因組時(shí)代的基因組學(xué)是一個(gè)令人興奮的浩瀚領(lǐng)域，我們才剛剛?cè)腴T。
結(jié)合視頻，我們用純技術(shù)語(yǔ)言重新解釋上面提到的三個(gè)關(guān)鍵技術(shù)（搬磚）：
DNB技術(shù)
基因組DNA首先經(jīng)過(guò)片段化處理，再加上接頭序列，并環(huán)化形成單鏈環(huán)狀DNA，隨后使用的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification, RCA）可將單鏈環(huán)狀DNA擴(kuò)增2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物稱為DNA納米球（DNA nanoball, DNB），最終納米球經(jīng)過(guò)DNB裝載技術(shù)固定在陣列化的硅芯片上。
與其他二代測(cè)序技術(shù)相比較，DNB測(cè)序技術(shù)具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：
（1）DNB通過(guò)增加待測(cè)DNA的拷貝數(shù)而增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度，從而提高測(cè)序準(zhǔn)確度；
（2）不同于PCR指數(shù)擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增錯(cuò)誤不會(huì)累積；
（3）DNB與芯片上活化位點(diǎn)的大小相同，每個(gè)位點(diǎn)只固定一個(gè)DNB，保證信號(hào)點(diǎn)之間不產(chǎn)生相互干擾；
（4）陣列化測(cè)序芯片和DNB測(cè)序技術(shù)的結(jié)合，使得成像系統(tǒng)像素和測(cè)序芯片的面積得到最大化利用。
Pattern array技術(shù)
華大基因測(cè)序芯片的規(guī)則陣列（PatternArray）采用先進(jìn)的光刻和干法刻蝕技術(shù)，在硅片表面形成陣列和對(duì)準(zhǔn)標(biāo)記，通過(guò)“涂敷深紫外光刻膠--陣列圖案曝光—顯影暴露局部硅表面—汽相沉積（氨基硅烷修飾）”系列處理，來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA納米球的固定。硅片最后被分切成25mmX 75mm的小片，成為測(cè)序芯片的基底。
cPAS技術(shù)
首先DNA分子錨和熒光探針在DNB上進(jìn)行聚合，隨后高分辨率成像系統(tǒng)對(duì)光信號(hào)進(jìn)行采集，光信號(hào)經(jīng)過(guò)數(shù)字化處理后即可獲得待測(cè)序列。為了實(shí)現(xiàn)快速測(cè)序這一目標(biāo)，生化團(tuán)隊(duì)探索并優(yōu)化了大量反應(yīng)條件，并從上萬(wàn)個(gè)酶突變體中篩選得到最優(yōu)秀的測(cè)序酶，使生化反應(yīng)時(shí)間縮短到60秒完成。此外，算法團(tuán)隊(duì)的實(shí)時(shí)圖像處理軟件，通過(guò)自主開發(fā)的Sub-pixelRegistration算法，使圖像配準(zhǔn)精確度達(dá)到了亞像素級(jí)別，大大提高了堿基識(shí)別的準(zhǔn)確度；同時(shí)，通過(guò)Multi-threadparallel compression算法以及對(duì)執(zhí)行效率的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了圖像處理和堿基識(shí)別的實(shí)時(shí)化，數(shù)據(jù)處理速度處于同行業(yè)領(lǐng)先水平。
參考：
