近期，美國康奈爾大學(xué) Samie R. Jaffrey 研究組在?Cell?上發(fā)表了題為 “A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m6A-Modified mRNA” 的研究，揭示了 YTHDF 蛋白調(diào)節(jié) m6A 修飾的 mRNA 的功能統(tǒng)一模型。
與“不同的 m6A 位點(diǎn)結(jié)合不同的 DF 蛋白”的主流觀點(diǎn)不同，該研究人員發(fā)現(xiàn)，所有 m6A 位點(diǎn)與三個(gè) DF 蛋白都以基本相似的方式結(jié)合，它們以冗余的作用方式誘導(dǎo)同一子集的 mRNA 降解，沒有證據(jù)表明它們能直接促進(jìn)翻譯。
圖?1.YTHDF?蛋白調(diào)控m6A?修飾的 mRNA 的功能模型
m6A?(N6-methyladenosine)：是指腺嘌呤核苷 N6 位置發(fā)生了甲基化修飾。m6A 是真核 mRNA 最普遍的內(nèi)部修飾，在功能上調(diào)節(jié)真核轉(zhuǎn)錄組，影響 mRNA 的剪接、輸出、定位、翻譯和穩(wěn)定性。
m6A修飾有三類調(diào)節(jié)器：
Writer??甲基轉(zhuǎn)移酶?(MTC)，負(fù)責(zé)催化，例如 METTL3、METTL14 和 WTAP；
Eraser??去甲基化酶 (Demethylase)，負(fù)責(zé)去除甲基化，例如 FTO 和 ALKBH5；
Reader??直接識別和結(jié)合?m6A?位點(diǎn)，使?m6A?修飾的 RNA 發(fā)揮特定的作用，主要包括 YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3?等。
YTHDF：一種?m6A“閱讀器”，即?Reader。胞質(zhì)中的 YTHDF 家族包括了 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3?三種旁系同源物 (paralogs)，也可以簡稱為?DF1、DF2、DF3。據(jù)報(bào)道，三種 DF 有不同的功能，DF1 促進(jìn) mRNA 的翻譯，DF2 促進(jìn) mRNA 的降解，DF3 促進(jìn)翻譯和降解。
關(guān)于 DF 旁系同源物選擇性地結(jié)合不同的 m6A 位點(diǎn)的機(jī)制目前尚未清楚。此外，DF 蛋白功能差異的機(jī)制基礎(chǔ)也仍不清楚，尤其是在它們同源性很高的情況下。
圖 2. 研究亮點(diǎn)
首先，研究人員觀察?DF1 和 DF2 YTH 結(jié)構(gòu)域與含有?m6A?的 RNA 的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中，DF 蛋白結(jié)合m6A 的氨基酸以及結(jié)合近端的氨基酸都是保守的，因此三個(gè) DF 蛋白與?m6A 結(jié)合的結(jié)構(gòu)機(jī)制是相同的。
DF 旁系同源物結(jié)合?m6A?序列基序 (Sequence motifs) 的差異反映可以其結(jié)合特性，研究發(fā)現(xiàn)?m6A?殘基幾乎只存在?DR-m6A-CH (D = A, G, U; R = A, G; H = A, C, U)?這一個(gè)高度保守的序列基序中，像GG-m6A-CU、AG-m6A-CU 都屬于DR-m6A-CH 的亞基序?(Submotif)?。
為了確定每種 DF 的結(jié)合偏好，研究人員通過全轉(zhuǎn)錄組 iCLIP 圖譜，檢測了?HEK293T 細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的 DF1、DF2 和 DF3 的結(jié)合位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)三種 DF?結(jié)合位點(diǎn)序列亞基序的偏好相同。再結(jié)合已報(bào)道的 PAR-CLIP 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)即使用不同的細(xì)胞系和不同的 CLIP 方法，DF 旁系同源物的 RNA 結(jié)合基本相同。因此，?DF 旁系同源物的?m6A 結(jié)合模式相同。
圖 3. DF 蛋白與m6A結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組分析
但是，不同的 DF 如何對m6A-mRNAs 發(fā)揮不同的分子效應(yīng)這個(gè)問題仍未解決，研究人員又分析了 DF 旁系同源物之間的效應(yīng)區(qū)域差異，以及它們的相互作用蛋白 (不同的 DF 蛋白可能通過與不同的蛋白相互作用介導(dǎo)其不同的功能)。結(jié)果顯示，DF 旁系同源物的序列、功能域、相互作用蛋白和細(xì)胞內(nèi)定位都高度相似。
此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)?DF 蛋白與降解有關(guān)的因子相互作用可信度較高，與翻譯相關(guān)的因子相互作用可信度較低。
根據(jù)已有報(bào)道，研究人員考慮到每種 DF 蛋白都有介導(dǎo)?m6A-mRNA 降解的可能性。于是，他們利用 siRNA 選擇性敲降 HeLa 細(xì)胞中的 DF1、DF2 和 DF3，使用 RNA-seq 檢測 mRNA 的豐度，證實(shí)是 DF2 影響了?m6A-mRNA 穩(wěn)定性，而非 DF1 或 DF3。
圖 4. DF 蛋白冗余地控制?m6A-mRNA 的豐度和穩(wěn)定性
再對 DF?進(jìn)行不同組合的雙重敲降和三重敲降，并利用放線菌素 D (Actinomycin D)??抑制轉(zhuǎn)錄后 m6A-mRNA 的水平證明了：DF 蛋白的聯(lián)合活性導(dǎo)致 m6A 修飾的 mRNA 降解，DF旁系同源物在功能上可以互相補(bǔ)償，這種補(bǔ)償功能也受其表達(dá)水平限制。當(dāng)三種 DF 都耗竭時(shí)，補(bǔ)償就不會發(fā)生，這時(shí) m6A-mRNA 的穩(wěn)定性得到最大程度的提高。
接下來，研究人員檢測了 DF 在?m6A-mRNA 的翻譯調(diào)控中的作用。三種 DF 都與多聚核糖體組分無關(guān)，而富集于信使核糖核蛋白 (mRNP)?組分，該結(jié)果與 “DF?蛋白(任何一種) 穩(wěn)定地結(jié)合至 mRNA?3'UTR，增強(qiáng)其翻譯的模型” 不一致。
任何的 DF 旁系同源物基因沉默都不影響 HeLa 細(xì)胞中 mRNA 的翻譯效率，即使是 DF 三重敲降也沒有顯著降低翻譯效率。因此，任何一種 DF 同源旁系物都不能直接增強(qiáng) mRNA 的翻譯，相反的，它們的主要作用是介導(dǎo) m6A-mRNA 降解。
圖 5. DF 蛋白冗余地抑制白血病細(xì)胞的分化
已有報(bào)道 DF2 在急性髓系白血病 (AML)?中過表達(dá)，與 AML 的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，DF2 的缺失導(dǎo)致一些抑制 AML 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，例如在 DF2 敲除的白血病前期細(xì)胞中，TNFRSF1B?轉(zhuǎn)錄本的半衰期增加，表面 TNFR2?的表達(dá)量上升。
為探索?TNFRSF1B?的抑制是否是通過三種 DF 蛋白共同作用介導(dǎo)，研究人員對??MOLM-13 白血病細(xì)胞中的 DF 進(jìn)行單獨(dú)或聯(lián)合敲降，發(fā)現(xiàn)TNFRSF1B?mRNA 表達(dá)水平受DF 的單獨(dú)敲降影響較小，其中僅 DF2 的敲降使其略微升高，在三重敲降后卻顯著上調(diào)。因此，在 MOLM-13 細(xì)胞中?DF 蛋白共同作用控制 m6A-mRNA 的表達(dá)水平。
小M 的思考
m6A?修飾已被證明與多種癌癥的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)，小分子靶向m6A?修飾調(diào)節(jié)器是一種極具潛力的癌癥治療方法。
相關(guān)抑制劑作用
SAH氨基酸衍生物和幾種代謝途徑中的調(diào)節(jié)劑。METTL3-METTL14 異二聚體復(fù)合物?(METTL3-14)?的抑制劑
3-DeazaadenosineS-腺苷高半胱氨酸 (SAH)?水解酶抑制劑；通過抑制 SAH 水解來抑制?m6A?基團(tuán)插入 mRNA 底物中
IOX1甲基轉(zhuǎn)移酶?ALKBH5?抑制劑
FB23-2有效、選擇性的?mRNA?m6A去甲基酶?FTO?抑制劑
FG-2216/IOX3HIF-PHD 抑制劑；在體外對 FTO 有抑制作用
Rhein可逆地與 FTO 催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并競爭性地阻止了對 m6A?修飾底物的識別
Entacapone特異的外周活性的鄰苯二酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶 (COMT) 抑制劑；競爭性 FTO 抑制劑
Meclofenamic?acid非甾體類抗炎化合物；FTO 抑制劑
縮寫：
MTC:Methyltransferase?complex
YTHDF: YT521-B homology domain-containing family/YTH domain family
