MTT、CCK8法
? ? ?技術(shù)原理：MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的簡(jiǎn)稱，商品名為噻唑藍(lán)?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。然后采用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
? ? CCK8法原理是WST-8四唑鹽（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）能被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原成橙色甲臜染料，然后測(cè)定450 nm下的吸光值，生成的甲臜的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。CCK8法可以做6天左右的生長(zhǎng)曲線，1-6天每天收取細(xì)胞樣本檢測(cè)。也可以類似MTT法，在相同時(shí)間比較不同處理組。
BrdU、EdU法
? ? ? ?技術(shù)原理：BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，可以代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，這種置換可以穩(wěn)定存在，并傳遞到子細(xì)胞中。細(xì)胞經(jīng)固定和變性處理后，可以用免疫學(xué)方法檢測(cè)DNA中的BrdU的含量，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。
? ? ? ?EdU也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中代替胸腺嘧啶插入正在復(fù)制的DNA中。EdU與熒光染料可以特異性地反應(yīng)檢測(cè)DNA的復(fù)制。
CFSE檢測(cè)
? ? ? ?技術(shù)原理：羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)。CFSE被細(xì)胞吸收后，不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上。隨著細(xì)胞增殖分裂，細(xì)胞內(nèi)CFSE的含量被平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，子細(xì)胞熒光強(qiáng)度減半。隨著細(xì)胞的增殖，CFSE不斷被稀釋，使用流式細(xì)胞儀對(duì)CFSE進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行分析。
免疫組化檢測(cè)
? ? ? ?技術(shù)原理：使用免疫組化的方法對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)抗原-Ki-67、PCNA進(jìn)行檢測(cè)。這類標(biāo)志物只表達(dá)在增殖細(xì)胞中，常用于反映體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
細(xì)胞克隆形成
? ? ? ?技術(shù)原理：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對(duì)殺傷因素敏感性等的重要技術(shù)方法。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0 mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力。各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)方法可以對(duì)細(xì)胞的克隆形成能力進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。
細(xì)胞遷移
Transwell檢測(cè)
? ? ? ?技術(shù)原理：細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞遷移為細(xì)胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細(xì)胞體尾部收縮在時(shí)空上的交替過(guò)程。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一，是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育的生理過(guò)程，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式。
? ? ? ?Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。
細(xì)胞侵襲
Transwell檢測(cè)
? ? ? ?技術(shù)原理：細(xì)胞侵襲是指細(xì)胞向局部侵犯，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)可用來(lái)研究細(xì)胞和胞外基質(zhì)之間的相互作用。胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供了結(jié)構(gòu)支架，同時(shí)也包含了許多細(xì)胞生存及生長(zhǎng)過(guò)程中生物功能因子。細(xì)胞可以分泌酶，用于降解胞外基質(zhì)中特定的組分，從而使細(xì)胞可以在細(xì)胞間質(zhì)中移動(dòng)。胞外基質(zhì)膠模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)胞外基質(zhì)環(huán)境，包含了支撐細(xì)胞結(jié)構(gòu)的最基本的組分。轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞由于其高遷移和/或降解胞外基質(zhì)的酶活從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性。
? ? ? ?鋪有 Matrigel 膠的 Transwell 小室可用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以鋪有 Matrigel 膠聚碳酸酯膜相隔，Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無(wú)聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8 μm，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以細(xì)胞小室上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開(kāi)始穿膜運(yùn)動(dòng)。腫瘤細(xì)胞穿過(guò)重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。
細(xì)胞凋亡
Annexin V-PI雙染色流式檢測(cè)
? ? ? ?技術(shù)原理：在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
Caspase3活性檢測(cè)
? ? ? 技術(shù)原理：Caspase3是細(xì)胞凋亡最重要的執(zhí)行蛋白之一，對(duì)其功能/活性的檢測(cè)可以反映細(xì)胞的凋亡情況?？梢允褂肳estern Blot檢測(cè)細(xì)胞中Caspase3蛋白的表達(dá)水平或者使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞群體中Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
細(xì)胞周期
PI（碘化丙啶）染色
? ? ? ?技術(shù)原理：細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開(kāi)細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的 DNA 含量不同，通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此，通過(guò)流式細(xì)胞儀 PI 染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對(duì)應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。
