做Western Blot的人，手機(jī)里大概都存著幾張“不忍直視”的膜。
目的條帶的位置，淺淺的，若有若無。倒是它上上下下，多了好幾道深淺不一的“鬼影”。你盯著那張膜，開始復(fù)盤每一個(gè)步驟：封閉夠不夠久？洗膜夠不夠勤？二抗是不是過期了？折騰一圈，換了所有能換的條件，那些雜帶還在那兒，跟你大眼瞪小眼。
最后換了一支抗體，世界清凈了。
那一瞬間你才明白：原來不是你的手有問題，是你手里的工具，不夠“干凈”。
雜帶這件事，做蛋白的人都不陌生。它可能是非特異性結(jié)合——抗體認(rèn)錯(cuò)了人，把結(jié)構(gòu)相似的其他蛋白也揪了出來。也可能是背景太高——抗體本身不夠純，帶著一堆“閑雜人等”一起顯影。最讓人頭疼的是，有時(shí)候雜帶和目的條帶離得太近，你想切都切不干凈，只能眼睜睜看著那張“花臉”的膜，放棄這篇數(shù)據(jù)。
我做實(shí)驗(yàn)?zāi)菐啄?，就被這種雜帶折磨過不止一次。
有一次做某個(gè)激酶的檢測，目的條帶在55kD左右。結(jié)果跑出來，55那兒確實(shí)有條帶，但45、70、甚至100多kD的地方，也各有一道。我以為是裂解不充分，換了新鮮樣本，重跑，雜帶還在。我以為是封閉液的問題，換了BSA、脫脂奶粉、甚至進(jìn)口的專用封閉劑，雜帶只是淡了一點(diǎn)，依然在。折騰了整整兩周，最后借了隔壁實(shí)驗(yàn)室的一支抗體跑了一板，條帶干凈得像教科書配圖。
那種挫敗感，不是“沒結(jié)果”，而是“有時(shí)間、有樣本、有設(shè)備，但結(jié)果就是不能用”。
雜帶的本質(zhì)，是抗體的特異性沒做到極致。它不是沒認(rèn)出目標(biāo)，而是認(rèn)出了太多不該認(rèn)的東西。在復(fù)雜樣本里，成千上萬種蛋白擠在一起，如果抗體對那些結(jié)構(gòu)相似的“路人”也來者不拒，結(jié)果就是膜上一片混亂。
這也是為什么，這些年我開始格外在意抗體的“出身”——不只是看它能不能出條帶，更看它在最復(fù)雜的樣本里，能不能做到“眼里只有你”。
兔抗體之所以在WB里越來越受歡迎，不是沒有原因的。兔子的免疫系統(tǒng)天生擅長識別那些精細(xì)的表位，尤其是磷酸化位點(diǎn)、小分子修飾這些“刁鉆”的靶點(diǎn)。而且兔單抗的親和力往往能做到皮摩爾級別，比鼠抗體高出幾個(gè)身位。但所有這些優(yōu)勢，如果不能轉(zhuǎn)化成“特異性”，就等于零。
特異性的本質(zhì)，是一場“篩選”的藝術(shù)。
免疫原設(shè)計(jì)的時(shí)候，就要把那些可能引起交叉反應(yīng)的區(qū)域提前避開。負(fù)責(zé)優(yōu)品生物抗原設(shè)計(jì)的小陳，有個(gè)習(xí)慣：拿到一個(gè)新靶點(diǎn)，先不做任何設(shè)計(jì)，而是把它的所有同源家族成員的序列調(diào)出來，一個(gè)氨基酸一個(gè)氨基酸地比對。那些高度保守的區(qū)域，直接劃掉——這些地方做出來的抗體，一定會認(rèn)錯(cuò)人。那些差異最大的區(qū)域，標(biāo)紅——這些才是真正的“身份證”。
但這只是第一步。有些區(qū)域序列差異很大，但在折疊后的蛋白表面可能藏得很深，根本露不出來；有些區(qū)域序列差異很小，但恰好位于蛋白表面的凸起上，反而成了最好的識別位點(diǎn)。小陳的電腦里存著一個(gè)叫“翻車現(xiàn)場”的文件夾，里面全是他踩過的坑。有一次，他選了一段序列差異很大的區(qū)域做免疫原，結(jié)果出來的抗體ELISA表現(xiàn)完美，但一流式就垮了。后來解析結(jié)構(gòu)才發(fā)現(xiàn)，那段區(qū)域在天然蛋白上被一個(gè)糖基化位點(diǎn)蓋住了，根本接觸不到。
從那以后，他的設(shè)計(jì)流程里多了一步：先預(yù)測翻譯后修飾位點(diǎn)，再設(shè)計(jì)免疫原?！暗鞍撞皇锹愕?，它穿著衣服。你得知道它的衣服穿在哪，才能找到它身上真正露出來的肉。”
免疫原設(shè)計(jì)好了，接下來是怎么讓兔子產(chǎn)生“對”的免疫應(yīng)答。優(yōu)品生物負(fù)責(zé)免疫的老韓，有一套自己的理論：兔子的免疫系統(tǒng)像一張白紙，你怎么“教”它，它就怎么應(yīng)答。你希望它只認(rèn)那個(gè)特定位點(diǎn)，就得在免疫的過程中，不斷用那些“不該認(rèn)”的蛋白做負(fù)向篩選，讓兔子的免疫系統(tǒng)先學(xué)會把這些“親戚”當(dāng)成自己人。
這套方法，是老韓花了十幾年時(shí)間摸索出來的。他說：“讓兔子幫你做篩選，比你在體外做一百遍純化都管用。畢竟，免疫系統(tǒng)是天生的化學(xué)家。”
再好的免疫程序，血清里也一定會有雜抗體。這是多抗的宿命——因?yàn)樗緛砭褪且蝗嚎贵w的混合物。優(yōu)品生物的純化團(tuán)隊(duì)，做的就是“清洗”的活。但他們的“清洗”，不是簡單地把血清過一遍親和柱就完事。
負(fù)責(zé)純化的老趙，有個(gè)獨(dú)門絕技叫“兩步淘汰法”。第一步，用目標(biāo)蛋白做親和純化，把能結(jié)合目標(biāo)蛋白的抗體全部拉下來。第二步，把這些抗體再過一遍吸附柱——柱子上偶聯(lián)的是那些同源蛋白的混合物。能結(jié)合上去的，說明還是會交叉反應(yīng)，篩掉；流穿下來的，才是只認(rèn)目標(biāo)蛋白的“精英”。
這個(gè)過程，每過一遍，抗體的回收率就掉一截。有時(shí)候掉30%，有時(shí)候掉一半。但老趙從不心疼。他說：“回收率高，客戶高興一次；特異性好，客戶高興一輩子。這筆賬，我算得清。”
優(yōu)品生物的用戶反饋里，有一條讓我印象很深。一個(gè)客戶做cGAS的Western Blot，反饋只有八個(gè)字：“抗體效果好，實(shí)驗(yàn)零失敗?！?span>-6 聽起來平淡，但做過WB的人都知道，能把“零失敗”這三個(gè)字說出口，背后是多少次的雜帶、背景、非特異性，被默默地?fù)踉诹碎T外。
還有一個(gè)客戶做JNK1/2/3的磷酸化檢測，反饋是“抗體效果好，實(shí)驗(yàn)零失敗”-6。磷酸化抗體是雜帶的“重災(zāi)區(qū)”，能把這種靶點(diǎn)跑干凈，需要的不只是親和力，更是極致的特異性。
在優(yōu)品生物的實(shí)驗(yàn)室里，有個(gè)不成文的傳統(tǒng)：每一個(gè)新項(xiàng)目啟動前，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人要在白板上畫一張“認(rèn)親圖”——左邊是目標(biāo)蛋白，右邊是它的幾個(gè)“親戚”，然后畫一個(gè)箭頭，從目標(biāo)蛋白指向抗體，再畫幾個(gè)叉，從那些“親戚”身上穿過-8。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人老周說：“做抗體之前，先搞清楚它不該認(rèn)誰，比搞清楚它該認(rèn)誰更重要?！?span>-8
這話，點(diǎn)透了定制實(shí)驗(yàn)級兔抗體的核心。
科研路上，變量已經(jīng)夠多了。樣本的差異、操作的誤差、儀器的波動，哪個(gè)都夠讓人頭疼?？贵w這種核心工具，能幫你減少一個(gè)變量，就減少一個(gè)。
那些抹不掉的雜帶，就讓它們留在別人的膜上吧。
