一代測(cè)序：Sanger測(cè)序原理
- 簡(jiǎn)單概述 雙脫氧終止反應(yīng)法，聚合酶延伸鏈 (由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng))
- 設(shè)置四個(gè)反應(yīng)體系1-4，分別加入引物、DNA聚合酶、四種dNTP、一定比例的ddNTP（帶有放射性標(biāo)記）例如1中是ddATP，它就負(fù)責(zé)測(cè)定T堿基的位置；
- 之后大批量的核苷酸反反復(fù)復(fù)的結(jié)合，把所有的位點(diǎn)都結(jié)合
- 最后利用凝膠電泳和放射自顯影只能看到帶有熒光標(biāo)記的ddNTP，先利用電泳條帶前后關(guān)系確定下他們的排列順序，再用ATCG關(guān)系反轉(zhuǎn)一下
- 優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確度很高，99.999%
- 缺點(diǎn) 一代最長(zhǎng)能測(cè)1000bp，再多了就要重頭開始一遍導(dǎo)致成本高；另外它一次只測(cè)一條，也就是所謂的通量低。
二代測(cè)序NGS步驟與原理(先看必備words,見下)
三平臺(tái)：Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa/Hiseq技術(shù)(占主要市場(chǎng)，PE（Pair End雙端）測(cè)序原理)、ABI公司的SOLID技術(shù)
雙端測(cè)序原理：如下
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建DNA文庫(kù)
超聲打斷，用酶補(bǔ)平為平末端，再在兩端加上互補(bǔ)配對(duì)的adapter(接頭)，再通過PCR擴(kuò)增達(dá)到一定濃度，構(gòu)成單鏈DNA文庫(kù)
adapter修飾，圖片來自生信星球**
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2. 上樣
- 步驟：建好的文庫(kù)中的待測(cè)序列→測(cè)序就在flowcell進(jìn)行，在特異的化學(xué)試劑作用下，強(qiáng)力隨機(jī)地附著在lane上，與上面的短序列配對(duì)，吸附住沖過來的DNA,再在表面進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增
- 注意：
- lane上有哪兩種接頭：lane上隨機(jī)分布兩種接頭，p5‘（與P5互補(bǔ)），P7（與P7'互補(bǔ)）
- 待測(cè)序列含有哪兩種接頭: 自帶了p5接頭和p7接頭
- lane與lane之間一般不會(huì)相互影響，也就是說一般不會(huì)出現(xiàn)lane1固定的DNA又與lane2結(jié)合。
- 序列只能一開始是利用p5接頭互補(bǔ)，因?yàn)閜7接頭和lane是一樣的
3. 橋式PCR
第一輪擴(kuò)增模版：flowcell表面固定的序列(模版鏈)，與lane接頭配對(duì)產(chǎn)生了補(bǔ)成雙鏈，后來強(qiáng)堿試劑作用下兩條互補(bǔ)鏈被分開，模版鏈被沖走，但是互補(bǔ)鏈穩(wěn)固定在lane上。接下來就要對(duì)互補(bǔ)鏈p5‘- p7‘ 進(jìn)行操作
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去雜：加入NaOH強(qiáng)堿性溶液使雙鏈DNA變性；模板鏈會(huì)被洗脫
圖片補(bǔ)充來自生信星球
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橋式形成： 加入緩沖溶液，互補(bǔ)鏈的p7‘和lane上的p7互補(bǔ)（但還是一個(gè)lane中的），形成了橋的樣子
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橋式PCR： PCR彎成橋狀，一輪橋式擴(kuò)增一倍
image.png 循環(huán)： 大約35個(gè)循環(huán)后，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，稱為cluster，這是一群完全相同的序列。目的在于實(shí)現(xiàn)放大單一堿基的信號(hào)強(qiáng)度，滿足后期測(cè)序需求
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解鏈： 橋式PCR完成后，形成了很多的橋形的互補(bǔ)雙鏈，再次強(qiáng)堿解鏈。這一次不再進(jìn)行復(fù)制，而是利用一種酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）選擇性的切掉lane 上p5‘ 連接的鏈，只留下了與lane p7連接的鏈，這就是Forward Strand（正鏈，相對(duì)應(yīng)的reverse strand 是負(fù)鏈）
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4. 測(cè)序（邊合成變測(cè)序）
4①雙端測(cè)序之Forward Strand
- primer結(jié)合到靠近p5的sequencing primer binding site1上(結(jié)合第一張圖片看)，再加入特殊的dNTP(它的3‘ 羥基被疊氮基團(tuán)替代，每次只能添加一個(gè)dNTP；還含有熒- 光基團(tuán)能激發(fā)不同顏色)；
- 在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉；
- 再加入激發(fā)熒光緩沖液，激光激發(fā)熒光信號(hào)，光學(xué)設(shè)備記錄熒光信號(hào)的記錄，再轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基
- 再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并使dNTP 3’ 疊氮基團(tuán)變成羥基，這樣能繼續(xù)向下進(jìn)行再加一個(gè)，并且保證這個(gè)不再發(fā)出熒光。如此重復(fù)直至所有鏈的堿基序列被檢測(cè)出。得到了Forward Strand序列
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4② Index測(cè)序
index1 primer和鏈上的index1 互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行index1的檢測(cè)，測(cè)完后，洗脫產(chǎn)物，得到index1 的序列。之后再橋式，再進(jìn)行index2的。圖片來自生信星球
image.png 4③雙端測(cè)序之Reverse Strand： 洗脫掉index2 產(chǎn)物后，還是一個(gè)橋式擴(kuò)增得到雙鏈，再變性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去測(cè)完的Forward strand。然后和測(cè)Forward一樣，也是先連接primer，只是連接的位點(diǎn)是Primer Binding Site2，測(cè)完后得到reverse strand序列
二代優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)循環(huán)就能測(cè)定flowcell上成千上萬(wàn)的cluster，這就實(shí)現(xiàn)了高通量；illunima一次只添加一個(gè)dNTP，確實(shí)能夠保證準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度問題
二代缺點(diǎn)：illumina會(huì)限制合成的鏈的長(zhǎng)度（原因在于測(cè)序長(zhǎng)度越長(zhǎng)，雜信號(hào)越多）
三代測(cè)序
- 單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序，超長(zhǎng)讀長(zhǎng)（可達(dá)二代測(cè)序的100倍以上），可直接檢測(cè)表觀修飾
- 目前以Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)為主流
- 特點(diǎn)
缺：準(zhǔn)確率低
優(yōu)：讀長(zhǎng)長(zhǎng)
必備words（需不斷更新）
flowcell： 測(cè)序反應(yīng)的載體/容器，1個(gè)flowcell有8個(gè)lane
lane： 測(cè)序反應(yīng)的平行泳道，試劑添加、洗脫等過程的發(fā)生位置
tile： 每次熒光掃描的位置，肉眼是看不到的
雙端測(cè)序： 可能序列比較長(zhǎng)有四五百bp，兩邊各測(cè)120-150bp
junction： 雙端測(cè)序中間一些沒有測(cè)到的區(qū)域
flowcell構(gòu)造：一個(gè)lane包含兩列（swath），每一列有60個(gè)tile，每個(gè)tile會(huì)種下不同的cluster，每個(gè)tile在一次循環(huán)中會(huì)拍照4次（每個(gè)堿基一次）
sequence by synthesis, SBS 邊合成變測(cè)序
同聚物：就是3‘端一個(gè)一個(gè)加dNTP聚合而成的聚合物，因?yàn)檫€帶接頭，所以不能直接說成DNA分子
一二三代測(cè)序總結(jié)與對(duì)比（引自生信星球）
二代測(cè)序主要平臺(tái)有：
1.羅氏454公司的GS FLX sequencer
2.Illumina solexa genome analyzer
3.ABI公司的SOLiD sequencer
可以參考的鏈接
測(cè)序的世界(上面內(nèi)容主要來自此，不理解的看著)
初涉測(cè)序
測(cè)序技術(shù)原理及常用數(shù)據(jù)格式簡(jiǎn)介
其他待看
DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展：第三代測(cè)序法
測(cè)序發(fā)展史：150年的風(fēng)雨歷程
名詞結(jié)構(gòu)化（有關(guān)于NGS組學(xué)的一些結(jié)構(gòu)，但不太懂）
