圖 2 |信號通路及其對naive和primed的多能狀態(tài)的影響。不同的信號通路可以正向或負向調(diào)節(jié)naive和primed的小鼠多能干細胞。請注意，顯示的大多數(shù)信號通路對小鼠的naive和primed的多能狀態(tài)具有相反的影響（例如，白血病抑制因子 (LIF) - 信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (STAT3) 和成纖維細胞生長因子 2 (FGF2 )–ERK 信號通路)。重要的是要強調(diào)，該計劃中未包括的其他途徑也可能參與此類監(jiān)管，并且將來可能會進一步表征。這些途徑可能包括 HIPPO、RHO、NOTCH 和核因子-κB 信號傳導。粉紅色方框突出顯示在調(diào)節(jié)小鼠和人類多能細胞中可能發(fā)揮不同作用的信號通路。更具體地說，低劑量的轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGFβ)、激活素-NODAL、核 β-連環(huán)蛋白或 FGF2（不依賴 MEK-ERK）誘導的信號傳導是否以不同的方式影響人類naive多能性仍有待充分了解以前在嚙齒動物naive胚胎干細胞中觀察到的。虛線箭頭表示仍有待建立的潛在鏈接。 BMP，骨形態(tài)發(fā)生蛋白； ESRRβ，雌激素相關(guān)受體-β； GSK3β，糖原合酶激酶 3β； JNK，君樣激酶； NuRD，核小體重塑和脫乙酰酶； OCT4，八聚體結(jié)合蛋白 4； PKC，蛋白激酶 C； TCF3，轉(zhuǎn)錄因子 3。改編自海報 http://www.nature.com/nrm/posters/pluripotency/index.html，自然出版集團。
圖 3 |小鼠和人類分離的多能干細胞 (PSC) 中的naive多能細胞特性。左側(cè)第一列列出了可用于區(qū)分在 2i/白血病抑制因子 (LIF) 條件下擴增的小鼠胚胎干細胞（naive多能細胞）和在成纖維細胞生長因子 2 (FGF2) 中擴增的小鼠上胚層干細胞的特性/激活素 A 條件（primed的多能細胞）。這兩個參考狀態(tài)用于注釋已用于小鼠或人類多能干細胞的各種其他生長條件。對于每種生長條件，我們指出在該條件下培養(yǎng)的細胞是否具有類似naive的特性（以橙色顯示）或類似primed的特性（以藍色顯示）?？湛虮硎救狈μ卣?。這份屬性列表可能會隨著時間的推移而增加，并可用于系統(tǒng)地注釋在獨特條件下和從其他物種中分離出來的新多能狀態(tài)；對于包含來自小鼠、大鼠、人類和恒河猴的多能細胞的擴展表，請參見補充信息 S1（圖）。
BMPi，骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑； DNMT1，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1； FBS，胎牛血清； H3K27me3，組蛋白 H3 Lys27 三甲基化； ICM，內(nèi)細胞團； JNKi，Jun樣激酶抑制劑； KLF，Krüppel 樣因子； MBD3，甲基 CpG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白 3； MEF，小鼠胚胎成纖維細胞； METTL3，甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白 3； OCT4，八聚體結(jié)合蛋白 4； OxPhos，氧化磷酸化； PGCLC，原始生殖細胞樣細胞； PKCi，蛋白激酶 C 抑制劑； PRDM14，PR 結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白 14； ROCKi，RHO 相關(guān)蛋白激酶 1 抑制劑； TFE3，轉(zhuǎn)錄因子 E3； TGFβ，轉(zhuǎn)化生長因子-β； TSC，滋養(yǎng)層干細胞。
*無雌激素相關(guān)受體-β (ESRRβ)。 ?小鼠宿主胚胎。改編自海報http://www.nature.com/nrm/posters/pluripotency/index.html，自然出版集團。
圖 4 |表觀遺傳抑制因子對小鼠naive和primed多能細胞的相反影響。小鼠naive和primed多能細胞的不同不僅在于它們對不同信號通路的依賴和它們的表觀遺傳特征，而且還在于它們的譜系決策。在 2i/白血病抑制因子 (LIF) 或胎牛血清 (FBS)/LIF 條件下擴增的小鼠naive胚胎干細胞 (ES 細胞) 可耐受 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1 (DNMT1)、甲基 CpG 結(jié)合域3 蛋白(MBD3)、DICER、DGCR8、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白 3 (METTL3)、EED 和 EZH2等表觀遺傳抑制因子的完全喪失蛋。此外，表觀遺傳抑制因子的喪失加強了有利于多能性促進因子的平衡，并產(chǎn)生了“超naive”多能細胞，這些細胞對分化具有相對更強的抵抗力，并且可以耐受 LIF 細胞因子的撤出。鼠primed的上胚層干細胞 (EpiSCs) 通常以相反的方式對表觀遺傳抑制因子的完全消融作出反應(yīng)。與naive多能細胞相比，已建立的小鼠primed的 EpiSC 自然下調(diào)多能因子并上調(diào)譜系因子。在primed多能性階段的表觀遺傳抑制因子的消融提示平衡分化和/或損害細胞存活。應(yīng)該注意的是，各種表觀遺傳抑制因子（如 METTL3 或 DGCR8）的消融總體上會對primed的多能性的穩(wěn)定性產(chǎn)生負面影響；然而，導致狀態(tài)崩潰的下游事件不一定在每種情況下都相同，因此應(yīng)該在體外和體內(nèi)徹底剖析。
FGF2，成纖維細胞生長因子 2。經(jīng) REF66許可改編 AAAS.。
人類常規(guī)多能細胞
從囊胚中分離出的第一批人類 ES 細胞在特征和組織培養(yǎng)要求方面與鼠 ES 細胞明顯不同。 FGF2 和轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGFβ1)/激活素 A 信號傳導（但不是 LIF 信號傳導）是維持此類源自 ICM 的常規(guī)人類 ES 細胞或通過直接體外重編程獲得的 iPSC 的核心信號傳導模塊。
primed的多能狀態(tài)。傳統(tǒng)常規(guī)人類和小鼠 ES 細胞之間的差異最初被歸因于物種之間未知的遺傳差異，因為人類 ES 細胞也來自 ICM，而不是來自植入后階段。然而，對來自不同小鼠品系的干細胞的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果未設(shè)計naive條件來匹配所用供體胚胎的特定遺傳背景的要求，ICM 細胞可以在體外適應(yīng)primed狀態(tài)。具體而言，與 129 小鼠相比，NOD 小鼠對產(chǎn)生naive ES 細胞和 iPSC 的“寬容度”相對較低，因為僅 LIF 不足以維持 NOD 小鼠細胞的naive多能性，并且永久需要 2i/LIF 條件來穩(wěn)定和維持naiveNOD PSCs30 的體外多能性。此外，來自 129 和 NOD 小鼠的 ICM 細胞在primed條件下擴增產(chǎn)生 EpiSC 樣細胞，這些細胞與來自 E6.5 胚胎的 EpiSC 或在體外來自已建立的 ES 細胞 30 無法區(qū)分。
人類常規(guī) ES 細胞和 iPSC 保留大量primed的多能性特征這一事實支持了后一種體外primed方案與確定常規(guī)人類 ES 細胞身份的相關(guān)性。這些包括naive多能性標志物（如 KLF17 和發(fā)育多能性相關(guān)蛋白 3（DPPA3））的低水平表達，H3K27me3 沉積在發(fā)育基因上，缺乏轉(zhuǎn)錄因子 E3（TFE3）的專一核定位，抑制 MEK-ERK 信號傳導后的多能性，缺乏在 ICM 細胞中的整體低甲基化現(xiàn)象，在大多數(shù)常規(guī)雌性 PSC 細胞系中缺乏前 X 失活狀態(tài)70,89,90。此外，人類primed的 ES 細胞不能耐受 DNMT1 的完全喪失（參考文獻 86），類似于小鼠 EpiSCs66（圖 4）所顯示的。迄今為止，人類 ES 細胞尚未實現(xiàn) DICER、MBD3 或 METTL3 的完全敲除64、66（圖 3）。
比鼠 EpiSC 的更少的primed狀態(tài)。盡管如此，重要的是要認識到人類常規(guī)或已primed的 ES 細胞與鼠 EpiSC 不同，并且可以被認為是相對較少primed的。例如，人 ES 細胞不會上調(diào) FGF5 或 N-鈣粘蛋白的表達（如在鼠 EpiSC 中所見），而人 ES 細胞表達高水平的 E-鈣粘蛋白（如在小鼠naive ES 細胞中檢測到的）70。人類 ES 細胞表達高水平的一些naive多能性標志物，例如 NANOG、PRDM14 和表達減少的蛋白 1（REX1；也稱為 ZFP42），這些標志物不被小鼠 EpiSCs91 表達或殘留表達。此外，人primed的 ES 細胞在功能上依賴于 NANOG 和 PRDM14，并且這些因子的消融誘導人 ES 細胞的分化 91。人 ES 細胞中 DNA 甲基化的分布對應(yīng)于在 FBS/LIF 條件下擴增的小鼠naiveES 細胞，而不是 FGF2/激活素 A 擴增的小鼠 EpiSCs，因為人 ES 細胞和小鼠naive ES 細胞的primed子是通過抑制性 DNA 甲基化保護免受入侵84,92。此外，雖然鼠 EpiSCs 表現(xiàn)出 TFE3 的專一性細胞質(zhì)定位，而naive 2i/LIF 培養(yǎng)的 ES 細胞顯示出 TFE3 的專一性核定位（參考文獻 93），但人類primed的 ES 細胞顯示出一種中間構(gòu)型，其中 TFE3 存在于細胞質(zhì)和細胞核中70。
人類naive多能細胞
naive和primed多能狀態(tài)的亞穩(wěn)定性取決于所使用的生長條件30，以及對外源因素的嚴格要求，以促進從以前“非允許”嚙齒動物菌株中分離的naive PSC 的naive多能性 30,31，導致考慮是否可以使用獨特和更嚴格的條件來隔離人類以前未識別的替代天真的多能狀態(tài)。
轉(zhuǎn)基因依賴。 2i/LIF 條件不足以維持naive的人類 ES 細胞或iPSCs94。然而，額外的轉(zhuǎn)基因表達可以誘導可能具有相當大的興趣的人工轉(zhuǎn)基因依賴狀態(tài)。持續(xù)的外源 OCT4 和 KLF4，或 KLF2 和 KLF4，轉(zhuǎn)基因表達可以在 2i/LIF 條件下將人類 ES 細胞和 iPSC 維持在獨特的多能狀態(tài)94。最近，通過優(yōu)化 KLF2 和 NANOG 轉(zhuǎn)基因的過表達來擴展這些觀察結(jié)果，允許在 2i/LIF 條件下擴增人類naive iPSCs95。 KLF2 和 NANOG 轉(zhuǎn)基因在primed ES 細胞中的過表達也使它們能夠在 2i/LIF/aPKCi 條件下擴增96。這些細胞具有廣泛的 DNA 低甲基化和naive多能性標志物的顯著上調(diào)，例如轉(zhuǎn)錄因子 CP2 樣蛋白 1 (TFCP2L1)、KLF2 和 KLF4。然而，由于 KLF2 在人類 ICM97 中不表達，且2i/LIF/aPKCi 條件不足以在沒有外源轉(zhuǎn)基因誘導的情況下轉(zhuǎn)化primed的 ES 細胞 96，并且由于無轉(zhuǎn)基因細胞在 2i/LIF/aPKCi 條件下仍有待驗證，因此它是不清楚在不保留可能泄漏的轉(zhuǎn)基因或 MEF 的情況下，這種狀態(tài)是否無限期穩(wěn)定。此外，對這些細胞中 DNA 甲基化景觀的獨立檢查表明，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因存在異常的全局印記丟失和過度低甲基化 89,98。最后，雖然 2i/LIF/aPKCi 條件不包含外源性 FGF 或 TGFβ1/激活素 A 細胞因子，但 FGF 受體 (FGFR) 和 TGF 受體 (TGFR) 信號傳導的短期抑制不足以證明細胞的獨立于FGF、TGF 和激活素 A 信號轉(zhuǎn)導 96（圖 2）。事實上，與小鼠不同，人類多能 ICM 在用 TGF 和激活素-NODAL 信號傳導的小分子抑制劑處理囊胚后會發(fā)生分化。
盡管該領(lǐng)域已轉(zhuǎn)向研究轉(zhuǎn)基因非依賴性條件，如下詳述，但應(yīng)注意轉(zhuǎn)基因依賴性狀態(tài)可能仍然很重要，因為目前在小鼠 ES 細胞中獲得的強大的naive多能性可能是嚙齒動物特異性的現(xiàn)象。捕獲與從小鼠獲得的相同的人類naive PSC 可能仍涉及基因改造。然而，以下研究提供的證據(jù)表明，在人類和其他物種中產(chǎn)生替代多能狀態(tài)是可能的 30,94。
不依賴轉(zhuǎn)基因。我們的團隊是第一個描述naive多能性生長條件 - 指定為 NHSM（naive人類干細胞培養(yǎng)基） - 這涉及完全消融 MEK–ERK 信號，并且與基因未修飾的人類 PSC 的無限擴張兼容，在兩種含有 MEF 的和無 MEF 條件下70。這些naive的不依賴 MEK 的多能細胞系可以來自人類植入前胚胎，通過從頭 iPSC 生成，或來自先前建立的primed ES 細胞和 iPSCs70。 NHSM 條件包含 2i/LIF 以及 p38 抑制劑 (p38i)、Jun N 末端激酶抑制劑 (JNKi)、aPKCi、RHO 相關(guān)蛋白激酶 1 抑制劑 (ROCKi) 以及低劑量的 FGF2 和 TGFβ1（或 Activin A）；它們使人類 PSCs 與鼠naive PSCs70 更相似但不相同（圖 2，3）。事實上，在 NHSM 中培養(yǎng)的人類細胞具有所謂的naive 2i/LIF 誘導的基態(tài)多能性特征，即使在 FBS/LIF 條件下擴增的naive小鼠 ES 細胞中也沒有發(fā)現(xiàn)這種特征。這些特征包括 TFE3 的獨家核定位和 H3K27me3 標記在發(fā)育基因上的去甲基化 69,70,93。在轉(zhuǎn)錄方面，這些細胞下調(diào)了 OTX2、ZIC2 和 CD24 等譜系定型標志物的表達，并適度上調(diào)了多能性基因的表達（在 MEF 上培養(yǎng)和使用 aPKCi 時更為顯著）70,99。在這些人類naive PSC 中已經(jīng)實現(xiàn)了增強子重新布線，如在小鼠細胞中所見 71。這些細胞的 DNMT3B100 表達下調(diào)，DNA 甲基化水平整體小幅下降，同時保持印記完整性和染色體穩(wěn)定性 70。盡管人類 PSC 的嵌合分析和使用人類胚胎作為宿主在倫理和法律上是被禁止的，但這些人類naive PSC 首次顯示，在顯微注射到宿主小鼠桑葚胚中后，真正整合到囊胚中，并且能夠在經(jīng)歷了晚期器官發(fā)生的 E10.5-E17.5 的小鼠胚胎的做出低級貢獻。 70（圖 3）。
此后出現(xiàn)了描述產(chǎn)生不依賴人類 MEK 的naive多能細胞的替代條件的重要文章，每一篇都描述了具有不同增強分子特性的細胞的產(chǎn)生（圖 3）。 2i/LIF、ROCKi、BMP 受體抑制劑 (BMPRi) 和高劑量 FGF2 和 TGFβ1 的組合只能在 MEFs101 存在的情況下維持人類 PSC。這些 PSC 具有多能性標記如 STELLA（也稱為 DPPA3）和 KLF5 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。另一項研究描述了使用在 NHSM70 中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)相同成分（2i/LIF、ROCKi 和 Activin A（而不是 TGFβ1）——有或沒有 FGF2 和 JNKi）但添加了 Ser/Thr 蛋白激酶 BRAF和 SRC 途徑抑制劑的培養(yǎng)條件 95（稱為 5i/LA-MEF 條件）。與以前的研究相比，5i/LA-MEF 條件下的細胞對naive多能性標志物的上調(diào)更為顯著。然而，這些細胞沒有下調(diào) DNMT3B 的表達，在雌性細胞系中保持非活性 X 染色體狀態(tài)，并且具有不尋常的前 ICM 轉(zhuǎn)錄特征95。有趣的是，在 5i/LA-MEF 條件下將primed的細胞轉(zhuǎn)換回naive狀態(tài)的過程效率低下，需要 2 周時間才能分離出保持緩慢生長速率的初始克隆 95。此外，這種條件下僅產(chǎn)生染色體異常細胞系95。因此，仍有待確定此類染色體異常是否實際上是 5i/LA-MEF 擴增細胞所固有的，并確定針對此狀態(tài)描述的特性 95，以及是否在這種低效的轉(zhuǎn)換過程中選擇它們。最后，這些細胞的 DNA 甲基化分析和表觀遺傳印記完整性是有待評估的重要方面。
從上述總結(jié)中可以清楚地看出，許多已發(fā)表的條件都不會產(chǎn)生與小鼠 ES 細胞或人類 ICM97、102、103 相同的人類naive PSC。然而，這些研究表明新的信號通路與人類naive多能性有關(guān)，并提出了進一步優(yōu)化和表征此類新型 PSC 的研究途徑（圖 2）。從機制上講，通過將 GSK3i/IWR1 條件 73 應(yīng)用于人類naive PSC 來測試 RAF 和 aPKC 抑制之間是否存在聯(lián)系以及調(diào)節(jié) WNT 信號傳導的影響將會很有趣。此外，已顯示 RHO 信號傳導可促進 YAP 和 TAZ 在primed的人類 ES 細胞中的核定位并維持它們的多能性 104。因此，ROCKi 是否通過 YAP 和 TAZ 的調(diào)制影響naive多能性特征仍有待確定。
MEK 非依賴性 FGF2 和 TGFβ1/激活素 A 信號傳導的作用，無論是以自分泌方式還是以低劑量外源提供，在人類naive PSC 中仍有待理解。這些細胞表現(xiàn)出激活素樣配體生長分化因子 3 (GDF3)96 的上調(diào)，而人（但不是小鼠）ICM 細胞大量表達激活素受體 97。因此，很容易推測，由于它們對激活素樣配體的反應(yīng)存在差異，已primed的人類 ES 細胞比鼠 EpiSCs 的primed相對較少，這可能會促進人類細胞中的一些naive特征70,95，但不會促進小鼠細胞中的某些naive特征。總之，系統(tǒng)分析來自不同物種的不同狀態(tài)的多能細胞對各種TGF-配體家族成員的反應(yīng)是重要的（圖2）。不能排除產(chǎn)生完全獨立于 FGF 和/或 TGF 信號傳導的人類 PSC 的可能性。
小鼠和人類上胚層之間的差異
最近關(guān)注人類植入前胚胎單細胞 RNA-seq 的研究開始為上面強調(diào)的一些問題提供答案。盡管人和小鼠胚泡之間沒有形態(tài)學差異，但它們在細胞水平上具有顯著的分子差異 97（圖 5a、b）。人類 ICM 上胚層細胞不表達 KLF2 和 ESRRB 等被認為是小鼠重要多能性因子的基因。相反，KLF17 可能在 ICM97 中具有人類特有的作用。GTPase ERAS，它是一種 ES 細胞特異性形式的RAS，已成為人類的假基因 105，而 ERAS 缺失的小鼠 ES 細胞在 FBS/LIF 條件下增殖緩慢 105。非人類靈長類動物（狨猴）多能上胚層具有與人類上胚層相似的轉(zhuǎn)錄特征，這與小鼠上胚層非常不同。狨猴和人類naive ICM 特征包括缺乏 KLF2、核受體亞家族 0 組 B 成員 1 (NR0B1) 和 BMP4 的轉(zhuǎn)錄，具有NODAL 及其下游信號介質(zhì)的高水平表達106。
在植入后階段，嚙齒動物和人類胚胎之間存在重大差異（圖 5a、b）。嚙齒動物的不尋常之處在于它們的植入后上胚層呈卵狀圓柱體形狀，而在人類中，植入后的上胚層呈扁平圓盤狀，類似于大多數(shù)其他哺乳動物。雖然不可能對早期人類植入后上胚層進行單細胞分析，但對非人類靈長類動物的研究可能會提供一些相關(guān)的見解?？偟膩碚f，物種之間的這些差異可能直接影響在體外不同物種的 PSC 中觀察到的不同多能特性及其不同的生長要求。此外，它們與了解體外分離的人類多能細胞的發(fā)育背景有關(guān)。
圖 5 |將“相對naive”分類在naive到primed多能性的范圍內(nèi)的模型| a. 小鼠和人類的早期植入前和植入后體內(nèi)發(fā)育存在重要的相似之處和差異。盡管小鼠和人類胚胎在胚泡階段之前在形態(tài)上是相似的，但存在重要的轉(zhuǎn)錄差異如 b 部分所述。此外，在植入后階段，小鼠和人類之間胚胎形狀的形態(tài)差異變得明顯，包括上胚層形狀和胚胎外結(jié)構(gòu)的差異。在小鼠中，naive胚胎干細胞 (ES 細胞) 可以來自植入前囊胚的內(nèi)細胞團 (ICM) 或在應(yīng)用naive生長條件時來自植入后上胚層。上胚層干細胞 (EpiSCs) 可以來自植入后上胚層或在使用primed培養(yǎng)條件時來自 ICM。因此，生長條件而不是細胞來源決定了體外獲得的多能狀態(tài)配置。根據(jù)所使用的生長條件，類似的情況適用于從人 ICM 中衍生naive和primed的多能細胞。由于倫理問題，多能細胞不能來自人類植入后的胚胎；因此，缺乏對這些細胞的分子分析。c |一個模型來解釋從naive到primed多能性的范圍內(nèi)的“相對naive”。在我們看來，可用于分離naive多能細胞和primed多能細胞的一個主要分子和功能標準是它們在阻斷 MEK 活性后維持和穩(wěn)定其多能狀態(tài)的能力（黑色虛線）。在naive多能狀態(tài)下，很難用絕對術(shù)語來描述細胞的多能狀態(tài)，因為naive細胞在某種程度上也可以具有primed多能性的特征。類似地，在primed的多能性范圍內(nèi)，在不同條件下培養(yǎng)的primed的多能細胞具有不同的特征和不同程度的naive（圖3）。最后，用非典型蛋白激酶 C 抑制劑 (aPKCi)、成纖維細胞生長因子受體抑制劑 (FGFRi) 或 NOTCH 抑制劑 (NOTCHi) 等小分子補充 2i/白血病抑制因子 (LIF) 條件是可能的naive多能性特征，特別是對于其他嚙齒動物如大鼠，naive細胞在 2i/LIF 無飼養(yǎng)層條件下的穩(wěn)定性應(yīng)進一步提高。對不同人類多能狀態(tài)的完整注釋將有助于繪制人類和其他靈長類多能干細胞的等效圖譜。 DNMT3L，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 3 樣； ERAS，ES細胞表達的RAS； ESRRB，雌激素相關(guān)受體-β； FBS，胎牛血清； GSK3i，糖原合酶激酶 3 抑制劑； KLF，Krüppel 樣因子； TGFRi，轉(zhuǎn)化生長因子受體抑制劑； XIST，X 非活動特異性轉(zhuǎn)錄本。 a 和 b 部分改編自 Nature Publishing Group 的海報http://www.nature.com/nrm/posters/pluripotency/index.html。 c 部分經(jīng) REF4 許可改編, 愛思唯爾。
多能狀態(tài)的分類
分離具有不同特征的人類naive PSC 的不同條件的表征，以及在人類中進行嵌合分析的局限性，激發(fā)了關(guān)于多能狀態(tài)分類的討論。人們經(jīng)常聲稱，在新設(shè)計的生長條件下從人類 ICM 細胞中獲得 ES 細胞的能力構(gòu)成了證明naive的“黃金標準”。然而，應(yīng)該記住，多能狀態(tài)身份最終取決于衍生生長條件，而不是細胞來源是植入前還是植入后上胚層30、33 或 PGCs82。使用 OCT4 遠端與近端增強子元素作為二元區(qū)分標記也可能被誤解 95。在人類和小鼠中，OCT4 的遠端和近端增強子元件在naive和primed的多能狀態(tài)下都是活躍的 107,108。差異來自它們的相對活動水平（高與低）和主導地位。
依靠單一屬性標記或功能測試來定義多能狀態(tài)是有局限性的，并且必須伴隨對不斷增加的特征數(shù)量的系統(tǒng)分析，這些特征不斷被識別為不同的多能狀態(tài)（圖 3，4）。然而，在我們看來，一個分子和功能特征可以被認為是naive和primed多能狀態(tài)之間的主要劃分，是細胞對阻斷 MEK 信號傳導的挑戰(zhàn)的反應(yīng)（圖 5c）。人類常規(guī) ES 細胞和小鼠 EpiSC 在 MEK 抑制后迅速分化，而naive多能細胞耐受 MEK 抑制并在這一挑戰(zhàn)后鞏固其naive性94。 MEK 或 ERK 抑制在 ICM 中擴大小鼠上胚層的能力以及它表明體內(nèi)naive多能性的鞏固這一事實支持了這一特征的重要性。
在多能性的naive和primed態(tài)中，很明顯，如果考慮最初針對小鼠naive 2i/LIF 培養(yǎng)的 ES 細胞和primed的 FGF2/激活素 A 培養(yǎng)的 EpiSCs 描述的許多naive和primed的多能性特征，則不同的多能性生長條件可以同時賦予同一細胞類型中的初始和naive特性的混合物（圖3）。因此，多能狀態(tài)可以通過具有更多此類屬性而被歸類為“更naive”或“更primed”（圖 5c）。人類primed ES 細胞具有naive多能性的幾個特征（例如保護primed子區(qū)域免受高甲基化和對 NANOG 的依賴），最近與人類胚泡單細胞 RNA-seq 的比較分析表明，一些常規(guī)人類 ES 細胞系在轉(zhuǎn)錄組方面比之前想象的相對更少的primed態(tài)97。在 FBS/LIF 條件下擴增的小鼠naive ES 細胞可以產(chǎn)生“全 ES 細胞”嵌合胚胎并耐受 Dnmt1 和 Mettl3 的消融；然而，如在 EpiSCs 中所見，它們在整體上被高度甲基化并獲得發(fā)育基因上的 H3K27me3 標記（圖 3,5c）。因此，與 2i/LIF 條件相比，F(xiàn)BS/LIF 條件似乎賦予小鼠 ES 細胞相對不那么naive的特性。
另一項可用于評估不同靈長類naive PSC 的嚴格性和naive程度的功能測試是細胞是否能耐受表觀遺傳抑制因子如 METTL3、DNMT1、DGCR8 和 MBD3 的完全消融（參考文獻 4,66）（圖 3， 4）。此外，此類測試可能有助于優(yōu)化可縮小小鼠和人類naive多能細胞之間差距的條件（框 1；圖 4）。根據(jù)這些標準，從迄今為止已分離的其他物種中注釋不同的naive和primed狀態(tài)也將是有益的（圖 3）。
BOX 1 |naive的多能性的“黑暗面”？隨著naive多能性培養(yǎng)條件的發(fā)展以及賦予細胞更多naive特征的努力，詢問需要多少naive以及永久維持多能干細胞（PSC）是否存在“黑暗面”在某些naive的條件變得相關(guān)。
在 2i/白血病抑制因子 (LIF) 條件下擴增的嚙齒動物胚胎干細胞 (ES 細胞) 獲得基因組異常的趨勢增加 41，目前尚不清楚這些改變是否是使用小分子抑制劑95,116 或作為naive多能性的內(nèi)在分子特征的直接結(jié)果（例如，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件的活性增加或表觀遺傳抑制標記的減少）。人們可以設(shè)想這樣一種情況，在這種情況下，這種特征可以在體內(nèi)被容忍，因為這種配置只存在 1-2 天，而這種狀態(tài)的長時間體外擴張可能會增加不需要的破壞性事件的頻率。
這種擔憂也可能與保護 DNA 甲基化的完整性和印記在體外擴展的naive PSC 中的完整性有關(guān)。專注于將小鼠 PSC 轉(zhuǎn)移到 2i/LIF 條件下 DNA 甲基化喪失的研究已經(jīng)量化了轉(zhuǎn)移后 10-24 天的甲基化水平，并記錄了 DNA 甲基化的快速全局喪失，伴隨著反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和印記區(qū)域的相對抗性這種去甲基化83。
然而，尚不清楚這種甲基化狀態(tài)是否代表naive細胞達到的最終平臺，或者在 2i/LIF 條件下進一步培養(yǎng)是否會導致這些區(qū)域?qū)θゼ谆南鄬剐越档?。事實上，?2i/LIF 條件下，印跡基因和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化發(fā)生了部分但卻顯著地降低。
如果這種影響經(jīng)常發(fā)生，研究人員將不得不重新評估如何優(yōu)化naive條件的應(yīng)用。一種情況可能涉及降低抑制劑水平以避免過度低甲基化或其他不良影響。另一種方案是將細胞維持在primed的多能性培養(yǎng)條件下，并在分化開始前將它們轉(zhuǎn)移到naive培養(yǎng)條件下的短時間內(nèi)。
影響和未來方向
體細胞有可能被重編程為多能性這一突破性發(fā)現(xiàn)為多能性狀態(tài)更深入的研究和理解多能配置可以重新布線奠定了基礎(chǔ)。重編程細胞以實現(xiàn)多能性的能力直接影響到與人類IPSCs的質(zhì)量和特性相關(guān)的當前障礙和限制(BOX1，2)。
與從naive到primed的多能性連續(xù)體相關(guān)的最有趣的問題之一是為什么存在這些不同的多能性配置。這通常伴隨著務(wù)實的考慮，即哪些細胞——naive的或primed的——更適合使用。在我們看來，由于這種現(xiàn)象深深植根于體內(nèi)早期胚胎發(fā)育，因此naive和primed配置都可能構(gòu)成發(fā)育過程中必不可少的組成部分，以同時優(yōu)化和最大化多能性和譜系規(guī)范的好處。我們假設(shè)naive多能性作為一種表觀遺傳擦除狀態(tài)出現(xiàn)，它使多能細胞不受譜系和表觀遺傳限制，同時使這些細胞對可能干擾這種譜系中性狀態(tài)建立的信號通路的反應(yīng)相對較低。在建立naive多能性期間或之后，在沒有短暫的“延遲期”的情況下，形態(tài)發(fā)生素對分化的誘導可能無法有效實施。因此，在植入后階段，naive的多能性網(wǎng)絡(luò)逐漸被解決并變得更容易接受感應(yīng)線索，并且在明顯的體細胞分化發(fā)生之前，PSC 根據(jù)它們的空間定位進行不同的圖案化和啟動。
在功能水平上，使用人類naive的PSCs作為起始材料，無論是否有短暫的primed階段，是否會解決目前與人PSCs體外分化方案相關(guān)的問題仍有待確定。人類naive的PSC會在獨立的IPSC系110之間增加分化的一致性嗎？當用作起始材料時，單純的PSC條件能在分化方案中產(chǎn)生更高質(zhì)量的細胞嗎？人類naive的PSCs可以用于人類常規(guī)PSCs不成功的分化方案嗎？最近的結(jié)果為這種可能性提供了令人鼓舞的支持，該結(jié)果顯示在NHSM條件下(即使在沒有aPKCi的情況下)擴增的人PSCs經(jīng)歷體外分化為PGC的能力增強，這是一項曾經(jīng)對于primed的人類PSCs 111來說效率不高的分化方案。評估以上強調(diào)的潛在益處的分子基礎(chǔ)是，與primed的多能性70，96相比，naive的多能性更多地與去除調(diào)節(jié)區(qū)的表觀遺傳抑制標記有關(guān)。這可能會在naive多能細胞分化過程中更有效地激活譜系說明子。此外，人類primed的PSCs中的譜系偏見與抑制標記的局部積累密切相關(guān)，例如DNA甲基化112。
在產(chǎn)生人類naive的PSCs方面的最新進展將繼續(xù)推動從其他物種產(chǎn)生naive的PSCs的嘗試，并測試相同物種和不同物種的胚胎嵌合體分析113。在NHSM條件下獲得的食蟹猴naive ES細胞產(chǎn)生了第一個來自非人類靈長類動物的嵌合體活性ES細胞114。在注射naive的人70或猴子IPSCs115后，獲得了發(fā)育成熟的小鼠胚胎(E10.5-E17.5)，并獲得了低水平的嵌合體。這些觀察提出了與定義這種整合的靈長類IPSC來源的細胞的頻率、線齡偏好和發(fā)育質(zhì)量相關(guān)的各種問題。系統(tǒng)的努力將是確定人性化動物模型70是否可能與疾病建模、人類發(fā)育研究或可移植人類組織的產(chǎn)生有關(guān)的關(guān)鍵113。
單細胞技術(shù)的持續(xù)突破及其在不同多能細胞類型和胚胎樣本中的應(yīng)用將有助于識別與PSCs充分功能相關(guān)的特性。這將有助于為以干細胞為基礎(chǔ)的治療和研究設(shè)定最佳起始材料的標準(BOX1)。預(yù)計，盡管人們正在調(diào)查這種之前被低估的多能性復(fù)雜性，以使科學家能夠更好地控制細胞命運，但擬議的準則和標準將需要辯論和修訂。
BOX 2 | 誘導多能干細胞 (iPSC) 重編程的潛在影響
最近的研究闡明了某些表觀遺傳調(diào)節(jié)因子如何對維持naive和primed的小鼠 PSC66 產(chǎn)生相反的影響（圖 4）。在比較人類與小鼠中多能性機制的誘導時，這些發(fā)現(xiàn)可能是相關(guān)的，因為人類 iPSCs 而不是小鼠 iPSCs，通常在常規(guī)（primed）多能性條件下重新編程 117。因此，在人和小鼠 iPSC 調(diào)節(jié)劑之間觀察到的一些差異可能與物種差異無關(guān)，而是與誘導不同的多能狀態(tài)有關(guān)。因此，必須擴展人類 iPSC 重編程調(diào)節(jié)器的篩選，以包括不同的多能性條件，因為這些條件可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果。
與多能狀態(tài)特征對重編程的影響有關(guān)的另一個考慮因素是naive條件是否可能提高獲得的 iPSC 的質(zhì)量并促進殘留表觀遺傳記憶和異質(zhì)性的喪失118,119。類似地，核移植胚胎干細胞和由相同人類供體細胞產(chǎn)生的 iPSC 之間 DNA 甲基化的細微表觀遺傳差異也可能在更接近模擬內(nèi)細胞團的表觀遺傳特征的naive條件下獲得 iPSC 時被中和。
