作者，Evil Genius
基因組 + 單細(xì)胞 + 空間，這個(gè)多組學(xué)的組合，我個(gè)人認(rèn)為是個(gè)風(fēng)口，但是，從取樣到分析都不容易。
今天我們分享多組學(xué)文獻(xiàn)，一作是中國(guó)人。
知識(shí)積累
組蛋白H3第27位賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸突變（H3-K27M）最常見(jiàn)于兒童腦橋彌漫性中線膠質(zhì)瘤（DMG），但在成人患者中也日益被發(fā)現(xiàn)。
采用單細(xì)胞多組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對(duì)涵蓋多年齡段和多解剖部位的H3-K27M DMG隊(duì)列進(jìn)行深入分析。通過(guò)解析共同K27M突變背景下年齡和部位依賴(lài)性環(huán)境如何影響細(xì)胞內(nèi)外特征，揭示了膠質(zhì)瘤空間和細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異的決定機(jī)制。
結(jié)果1、跨越不同年齡組和發(fā)病部位的H3-K27M彌漫性中線膠質(zhì)瘤患者隊(duì)列
對(duì)50例H3-K27M突變患者腫瘤進(jìn)行了多組學(xué)分析
對(duì)43例腫瘤進(jìn)行了深度全長(zhǎng)Smart-seq2新鮮單細(xì)胞（18例）或凍存單細(xì)胞核（25例）RNA測(cè)序（scRNA-seq/snRNA-seq）。此外，通過(guò)測(cè)序技術(shù)分析了8例腫瘤的開(kāi)放染色質(zhì)圖譜（scATAC-seq/snATAC-seq），并采用原位測(cè)序技術(shù)解析了14例腫瘤的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)。
為識(shí)別其他突變，我們對(duì)50例腫瘤中的43例進(jìn)行了全外顯子組或靶向外顯子組測(cè)序。
TP53、PDGFRA和PIK3CA的 recurrent突變?cè)谒邪茨挲g和部位分層的臨床解剖組中廣泛存在，而HIST1H3B和BRAF改變僅在兒童腫瘤中偶有檢測(cè)。
結(jié)果2、不同年齡與發(fā)病部位的H3-K27M DMG細(xì)胞組成特征
研究通過(guò)單細(xì)胞多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：H3-K27M突變型彌漫性中線膠質(zhì)瘤（DMG）普遍存在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）樣特征，該特征不受患者年齡或腫瘤部位影響，表明其由K27M突變本身的內(nèi)在機(jī)制驅(qū)動(dòng)；相反，間充質(zhì)樣（MES）特征顯著富集于成人腫瘤，且與遺傳突變無(wú)關(guān)，提示微環(huán)境等外在因素主導(dǎo)其形成。研究首次在DMG中發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特有的MES樣細(xì)胞群，并通過(guò)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析揭示了SOX10、TFEB等正常膠質(zhì)發(fā)育關(guān)鍵因子在腫瘤細(xì)胞中的異?；罨瑫r(shí)鑒定出GLI2、NFATC4等膠質(zhì)瘤特異性調(diào)控異常。
結(jié)果3、OPC樣細(xì)胞亞群的部位特異性分布
空間分布分析揭示這些亞群具有部位特異性：腦橋腫瘤顯著富集pre-OPC樣細(xì)胞（OPC樣-2/3），而丘腦腫瘤則以成熟OPC樣細(xì)胞（OPC樣-1）為主。這種分布模式在控制年齡因素后仍然存在，表明腫瘤部位是決定OPC樣細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)鍵環(huán)境決定因素。該發(fā)現(xiàn)首次系統(tǒng)揭示了H3-K27M DMG中OPC樣細(xì)胞的分化異質(zhì)性及其與解剖位置的關(guān)聯(lián)。
結(jié)果4、H3-K27M DMG細(xì)胞群體的開(kāi)放染色質(zhì)圖譜特征
為解析H3-K27M DMG細(xì)胞異質(zhì)性的染色質(zhì)調(diào)控機(jī)制，通過(guò)snATAC-seq檢測(cè)了8例腫瘤的單核可及染色質(zhì)圖譜，與其單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)形成互補(bǔ)分析。
通過(guò)關(guān)聯(lián)snATAC-seq檢測(cè)的可及染色質(zhì)區(qū)域與鄰近基因表達(dá)水平，我們鑒定出13,632個(gè)潛在CRE-靶基因?qū)?。其?87個(gè)基因具有高度復(fù)雜的調(diào)控位點(diǎn)（含>8個(gè)CREs），被定義為"預(yù)測(cè)性染色質(zhì)"關(guān)聯(lián)基因（GPCs）。OPC/OC樣細(xì)胞中GPCs數(shù)量顯著多于AC/MES樣細(xì)胞，表明少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系協(xié)同調(diào)控在H3-K27M DMG中占主導(dǎo)地位。這些GPCs與H3-K27M腫瘤超級(jí)增強(qiáng)子調(diào)控基因顯著重疊，提示其在協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞身份中的核心作用。
通過(guò)整合scRNA-seq推斷的TF活性與snATAC-seq分析的TF結(jié)合motif富集，重建了基因調(diào)控回路，鑒定出65個(gè)細(xì)胞狀態(tài)特異性轉(zhuǎn)錄因子。以O(shè)PC樣標(biāo)記基因SEZ6L為例：該基因在OPC樣細(xì)胞中差異表達(dá)且染色質(zhì)可及，其16個(gè)關(guān)聯(lián)CREs中含有SOX8結(jié)合位點(diǎn)，而SOX8本身在OPC樣細(xì)胞中呈現(xiàn)差異活性。所有腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的GPCs均顯示基因表達(dá)、染色質(zhì)可及性與特異性TF富集的三維互作關(guān)系（如AC樣標(biāo)記基因ITPKB受SOX9/NFATC4/RFX3調(diào)控網(wǎng)絡(luò)支配）。
通過(guò)多組學(xué)整合揭示：?jiǎn)渭?xì)胞染色質(zhì)可及性譜獨(dú)立驗(yàn)證了H3-K27M DMG的主要細(xì)胞譜系分類(lèi)；GPCs作為大型調(diào)控復(fù)合物的核心組件，在OPC/OC樣細(xì)胞中特異性富集，進(jìn)一步強(qiáng)化了少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系在H3-K27M DMG中的核心地位。
結(jié)果5、H3-K27M DMG中年齡特異性的髓系細(xì)胞圖譜
通過(guò)年齡與部位分層隊(duì)列，重點(diǎn)解析了腫瘤相關(guān)髓系細(xì)胞（TAMs）的組成特征。發(fā)現(xiàn)成人患者髓系細(xì)胞中單核來(lái)源巨噬細(xì)胞比例顯著更高，而兒童患者則以腦駐留小膠質(zhì)細(xì)胞為主，這種差異與腫瘤部位無(wú)關(guān)
機(jī)制研究表明：成人TAMs高表達(dá)OSM配體，其相應(yīng)受體OSMR在成人腫瘤細(xì)胞中同步上調(diào)，激活了已知誘導(dǎo)間充質(zhì)表型的OSM-OSMR信號(hào)通路。成人TAMs中MES樣標(biāo)記基因表達(dá)也顯著升高。通過(guò)對(duì)正常小鼠腦髓系細(xì)胞圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)OSM等配體和MES標(biāo)記基因的表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而升高，證實(shí)H3-K27M DMG中MES樣狀態(tài)的年齡依賴(lài)性富集與正常腦部髓系細(xì)胞隨發(fā)育衰老的變化趨勢(shì)一致。
研究還揭示了TAMs與OPC樣亞群間的配體-受體互作網(wǎng)絡(luò)，既存在OPC譜系共性互作（如SEMA3E-PLXND1），也存在亞群特異性互作，提示微環(huán)境因素可能通過(guò)不同機(jī)制強(qiáng)化OPC樣譜系并影響其成熟度。
成人H3-K27M DMG中單核來(lái)源巨噬細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞MES樣狀態(tài)密切相關(guān)，這種年齡特異性的免疫微環(huán)境通過(guò)分泌OSM等配體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)化轉(zhuǎn)變。該發(fā)現(xiàn)闡明了年齡相關(guān)微環(huán)境因素如何差異化塑造腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的新機(jī)制。
結(jié)果6、H3-K27M DMG的單細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)解析
通過(guò)基于雜交的原位測(cè)序技術(shù)（HybISS），對(duì)16例患者腫瘤組織切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，使用從scRNA-seq數(shù)據(jù)篩選的116個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記基因。空間細(xì)胞分型（pciSeq）顯示：AC樣細(xì)胞構(gòu)成主要惡性細(xì)胞區(qū)室，這與scRNA-seq中OPC樣細(xì)胞占主導(dǎo)的現(xiàn)象形成鮮明對(duì)比?？臻g分析還檢測(cè)到更豐富多樣的非惡性細(xì)胞類(lèi)型，且成人腫瘤中MES樣細(xì)胞比例顯著高于兒童腫瘤，正交驗(yàn)證了年齡與MES樣狀態(tài)的關(guān)聯(lián)。
鄰域富集分析揭示了顯著的空間異質(zhì)性。全局分析發(fā)現(xiàn)OPC樣/周期細(xì)胞與OC樣細(xì)胞存在更高共定位，通過(guò)CODEX多色免疫熒光技術(shù)在蛋白水平驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)——增殖性O(shè)PC樣和OC樣細(xì)胞形成有絲分裂生態(tài)位，外圍由分化型AC樣細(xì)胞環(huán)繞。血管細(xì)胞與MES樣腫瘤細(xì)胞空間鄰近性更高，提示間充質(zhì)狀態(tài)與血管增生的關(guān)聯(lián)。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞與MES樣、OC樣和AC樣癌細(xì)胞也顯示增強(qiáng)共定位。
通過(guò)計(jì)算聚類(lèi)系數(shù)和度中心性，發(fā)現(xiàn)AC樣細(xì)胞、非惡性星形細(xì)胞和TAMs傾向于異質(zhì)性聚類(lèi)（與其他細(xì)胞類(lèi)型混合），而血管細(xì)胞、神經(jīng)元和周期OPC樣細(xì)胞更傾向同質(zhì)性聚類(lèi)（形成特定結(jié)構(gòu)/生態(tài)位）。
本研究首次在原生腫瘤組織中解析了scRNA-seq定義的H3-K27M DMG細(xì)胞群體的空間結(jié)構(gòu)，揭示了少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系腫瘤細(xì)胞（OPC樣和OC樣）共定位形成的有絲分裂干細(xì)胞樣生態(tài)位，為開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤區(qū)域特異性生態(tài)位的治療策略提供了新方向。
本研究通過(guò)構(gòu)建H3-K27M彌漫性中線膠質(zhì)瘤的多組學(xué)單細(xì)胞圖譜，揭示了時(shí)空背景下腫瘤異質(zhì)性的雙重調(diào)控機(jī)制：一方面，K27M突變通過(guò)細(xì)胞內(nèi)在效應(yīng)普遍驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞向OPC樣狀態(tài)分化（與年齡和部位無(wú)關(guān)）；另一方面，腦橋腫瘤富集更幼稚的前體OPC樣細(xì)胞（部位特異性），而間充質(zhì)樣特征隨年齡增長(zhǎng)顯著增強(qiáng)（時(shí)間特異性），后者與年齡相關(guān)的髓系細(xì)胞微環(huán)境變化密切相關(guān)?？臻g分析首次發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)譜系腫瘤細(xì)胞（OPC樣/OC樣）形成的增殖性生態(tài)位，同時(shí)挑戰(zhàn)了單細(xì)胞測(cè)序中OPC樣細(xì)胞占主導(dǎo)的認(rèn)知——原位分析顯示AC樣細(xì)胞才是主要腫瘤群體，提示技術(shù)方法對(duì)細(xì)胞捕獲存在偏好性。該研究為理解時(shí)空因素如何協(xié)同塑造腫瘤細(xì)胞狀態(tài)提供了全新框架，為針對(duì)不同臨床解剖亞組開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)治療策略奠定了理論基礎(chǔ)。
最后來(lái)看看方法
單細(xì)胞部分
scRNA + scATAC聯(lián)合分析
空間鄰域分析
