【工作環(huán)境：R.studio】
1.Bulk RNA-seq(大量RNA-seq)、scRNA-seq、snRNA-seq的區(qū)別？
（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序即RNA-seq分為bulk、single cell、single nucleus三種測(cè)序技術(shù)）
傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（bulk RNA-seq）是基于群體細(xì)胞，每個(gè)樣本包含成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，所以最終反映的是基因在群體細(xì)胞中平均表達(dá)水平，從而掩蓋了不同細(xì)胞之間的表達(dá)異質(zhì)性。
單細(xì)胞測(cè)序不同于傳統(tǒng)的高通量測(cè)序，它是對(duì)于一個(gè)細(xì)胞群中的某一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序就是對(duì)單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行測(cè)序，它的優(yōu)勢(shì)是準(zhǔn)確地分析每一個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)，能準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞群體，并進(jìn)行細(xì)胞分類間比較，以及能找到稀有的細(xì)胞的表達(dá)情況。進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序前，首先需要分離單個(gè)的細(xì)胞，不同類型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，使用的細(xì)胞分離技術(shù)可能不一樣。（細(xì)胞分離技術(shù)分類匯總見： https://blog.csdn.net/AIPuFu/article/details/100174499）
而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)的區(qū)別在于單細(xì)胞測(cè)的是細(xì)胞質(zhì)+細(xì)胞核的遺傳信息，而單細(xì)胞核如其名，測(cè)的是細(xì)胞核內(nèi)的遺傳信息。因?yàn)閱渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)存在一些弊端。只能夠取樣于新鮮組織，而一些臨床的冷凍的樣本，無(wú)法得到利用。在解離的過(guò)程中，一些細(xì)胞這種應(yīng)激的條件下，基因的表達(dá)發(fā)生變化。同時(shí)，一些不易解離的細(xì)胞類型也會(huì)因此被過(guò)濾掉，而使我們最終的分析喪失一些重要的信息。由于細(xì)胞核膜相對(duì)于細(xì)胞膜是更加穩(wěn)定的，所以在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中也更加容易操作，從而規(guī)避了我們上面提到的一些單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的弊端，臨床冷凍的樣本的遺傳信息也能夠得到有效的利用。
雖然單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)只是測(cè)序了細(xì)胞核內(nèi)的遺傳信息，而沒(méi)有得到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的遺傳信息（如部分mRNA,因?yàn)槲覀冎?，成熟的mRNA,要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。）但從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，snRNA-seq的表現(xiàn)與scRNA-seq完全一致，同樣能夠準(zhǔn)確的捕捉到細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這一點(diǎn)已在不同組織、不同外界處理?xiàng)l件等多種情況下得到了證實(shí)。
2.單細(xì)胞測(cè)序中，10xgenomics測(cè)序中的10x是什么意思呢？是不是指的是測(cè)序深度？
10X genomics是他們公司的商標(biāo)就跟Illumina一樣，X表示字母讀作[eks]不是乘號(hào)的意思，所以也不是指測(cè)序深度。
3.什么是10X數(shù)據(jù)？
標(biāo)準(zhǔn)的10X數(shù)據(jù)（包含三個(gè)文件（barcodes.tsv/genes.tsv/matrix.mtx）挖掘公共單細(xì)胞數(shù)據(jù)集時(shí)，會(huì)遇到常見各種單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)格式。
例如：
（1）barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz
（2）表達(dá)矩陣
（3）h5
（4）h5ad
barcodes.tsv、genes.tsv、matrix.mtx格式數(shù)據(jù)文件
這是cellranger上游比對(duì)分析產(chǎn)生的3個(gè)文件，分別代表細(xì)胞標(biāo)簽(barcode)、基因ID(feature)、表達(dá)數(shù)據(jù)（matrix）
一般先使用read10X()對(duì)這三個(gè)文件進(jìn)行整合，得到行為基因、列為細(xì)胞的表達(dá)矩陣（為稀疏矩陣dgCMatrix格式，節(jié)約內(nèi)存）；然后再配合CreateSeuratObject()函數(shù)創(chuàng)建Seurat對(duì)象
3.什么是細(xì)胞的Gel bead，以及其組成部分？
單細(xì)胞測(cè)序的高通量化平臺(tái)，不得不提的就是10X Genomics。其技術(shù)核心包括兩部分：Gel Bead和油包水微液滴生成系統(tǒng)，后者也是微液滴法數(shù)字PCR儀（以Bio-Rad的產(chǎn)品為代表）的核心技術(shù)。Gel Bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成，引物序列中包含一段每個(gè)Gel Bead都各不相同的10X Barcode，用以區(qū)分不用的單細(xì)胞。將細(xì)胞懸液進(jìn)行充分稀釋后經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，形成微液滴和Gel Bead結(jié)合的GEM（Gel Beads-in-emulsion）。
Gel bead由四個(gè)部分組成。各有其各自的作用。
R1：為一段已知序列的DNA片段，用于后續(xù)的測(cè)序。
10X Barcode：用于標(biāo)記細(xì)胞。
獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（UMI）：unique Molecular identifiers 是在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中添加到轉(zhuǎn)錄本中的短隨機(jī)條碼（4-10bp）。它們可以將測(cè)序讀序列分配給單個(gè)轉(zhuǎn)錄分子，從而消除scRNASeq數(shù)據(jù)中的放大噪聲和偏差。當(dāng)對(duì)包含UMI的數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序時(shí)，技術(shù)通常只對(duì)包含UMI的轉(zhuǎn)錄本的末端（通常是3’端）進(jìn)行特定的測(cè)序。
? ? ? ? 在混合測(cè)序的過(guò)程中，用于區(qū)分不同的cDNA來(lái)源的reads。也就是在后續(xù)的建庫(kù)擴(kuò)增的過(guò)程中，cDNA不斷的擴(kuò)增產(chǎn)生reads,來(lái)源于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的reads的UMI相同。每一個(gè)細(xì)胞有一個(gè)特征的UMI。之后，在進(jìn)行擴(kuò)增建庫(kù)的過(guò)程中，只要是由該細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA,都會(huì)帶有這段UMI。
poly(dT)VN：通過(guò)與mRNA的polyA尾互補(bǔ)配對(duì)，捕獲細(xì)胞中游離的mRNA。
（2）建庫(kù)
通過(guò)某種方法，將細(xì)胞裂解，釋放出mRNA,利用逆轉(zhuǎn)錄酶，將mRNA反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA,進(jìn)行擴(kuò)增。而Gel bead所起到的作用就是，將我們細(xì)胞中的mRNA的序列信息捕獲，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方式，轉(zhuǎn)換為帶有特征的細(xì)胞標(biāo)記的reads。
由于這個(gè)平臺(tái)的測(cè)序過(guò)程是高通量的。所以，將所有的reads（來(lái)源于不同的細(xì)胞的不同的mRNA）都集中起來(lái)進(jìn)行測(cè)序。而后續(xù)的過(guò)程中，如何將這些不同來(lái)源的reads區(qū)分開來(lái)，就是利用我們的標(biāo)記。
一般而言，有幾個(gè)維度的標(biāo)記：
來(lái)自哪一個(gè)樣本（患者，如果是一個(gè)個(gè)體的某個(gè)組織的話，另當(dāng)別論）
來(lái)自哪一個(gè)細(xì)胞（因?yàn)槲覀円诩?xì)胞維度上，進(jìn)行表達(dá)量的識(shí)別，所以這部分的信息也很重要）——10X barcode
來(lái)自哪一個(gè)基因（通過(guò)基因的識(shí)別，我們知道是哪些基因的表達(dá)）——UMI
所以，最終表現(xiàn)在counts矩陣上，就是行為所在的細(xì)胞，列為基因，值為定量后的表達(dá)值。
