這篇文章于2023年6月發(fā)表于The?Journal?of?Clinical?Investigation（IF=15.9，Monocyte-derived macrophages orchestrate multiple cell-type interactions to repair necrotic liver lesions in disease models），主要探究了參與肝損傷修復的細胞及其具體機制，作者尋找新功能相關細胞群體的推導和驗證過程值得學習借鑒。

研究意義：肝臟具有極強的自我再生能力。肝臟部分切除和其它急性肝損傷模型常用于肝臟再生的相關研究，由于后者能誘發(fā)人類肝臟疾?。ú《拘愿窝住⒕凭愿尾?、非酒精性脂肪肝、自體免疫肝病和藥物引起的肝損傷等）進展過程里常見的組織壞死，因此是更加理想的研究模型。雖然多種肝臟疾病會誘發(fā)組織壞死，但壞死組織消融和修復的機制未知。

炎癥會使肝損傷惡化，同時又促進肝損傷修復和纖維化消融。本文作者用注射T細胞絲裂原concanavalin A (ConA) 探究肝損傷修復過程免疫細胞消融和修復壞死組織的機制。已知注射ConA后，肝臟會出現(xiàn)大量組織壞死，且壞死組織在數(shù)天內消融修復，但其機制未知。作者的預實驗結果顯示，單核細胞來源的巨噬細胞（MoMFs）是包裹壞死組織的主要細胞。正常肝組織主要含駐留的巨噬細胞Kupffer細胞，只有少量MoMFs。但肝損傷發(fā)生后，大量MoMFs通過CCL-2-CCR2受配體對浸潤到肝臟。已知Kupffer細胞和MoMFs在加重局部炎癥的同時，亦促進組織修復。之前的研究主要集中在浸潤MoMFs免疫和吞噬功能改變，對其促進壞死組織消融和修復的研究較少。

研究策略：?作者以“肝損傷誘發(fā)的肝組織壞死消融和修復機制”為科學問題，利用多個轉基因小鼠和腺病毒介導的組織特異性基因敲除，以及免疫組化、免疫熒光等實驗技術系統(tǒng)性地探討了參與肝損傷組織修復的細胞組分和來源，以及各組分細胞促進組織修復的機制，最后再結合其它肝損傷模型驗證自己理論模型的普適性。

研究方法：

1、MoMFs are aggregated and encapsulate the necrotic lesions following immune-mediated liver injury.

用ConA誘導小鼠發(fā)生肝組織壞死發(fā)現(xiàn)，壞死組織修復過程中會出現(xiàn)一群包裹壞死組織的CD45+免疫細胞，可將壞死組織和正常組織分割開來（圖1A）。分析包裹細胞成分顯示，MoMFs（IBA1+CLEC4F–：IBA1為巨噬細胞marker，CLEC4F為Kupffer細胞marker）從24h開始出現(xiàn)并逐漸增加，使用GFP+骨髓細胞進行移植實驗顯示，包裹壞死組織的細胞是骨髓來源的MoMFs（圖1B-C）?；罨涡菭罴毎╝HSCs，Desmin+α-SMA+）和中性粒細胞（MPO+）主要出現(xiàn)在后期（72-96h，圖1B）。Kupffer細胞主要位于未損傷組織，表明它們在肝損傷時被破壞，而且正常組織的Kupffer細胞不會遷移到壞死組織（圖1B）。Kupffer細胞通過分泌促炎因子誘發(fā)ConA引起的肝損傷，檢測發(fā)現(xiàn)，Kupffer活化和吞噬功能相關標志物表達在ConA注射6h后增加，隨后不再發(fā)生顯著改變（圖1D）。用Ccr2-/-、Cx3cr1-/-和Ccl2Hep-/-小鼠探究肝損傷募集MoMFs機制結果顯示，包裹壞死組織的肝細胞通過分泌CCL2募集MoMFs，敲除Ccr2能顯著抑制MoMFs向壞死組織浸潤，但對Kupffer細胞沒有顯著影響（圖1E-G）。因此，骨髓來源的MoMFs在肝損傷后被募集到壞死組織并將其包裹。

圖1

2、MoMFs trigger the formation of a cell death–resistant SOX9+hepatocyte layer encapsulating the necrotic areas via the JAG1/NOTCH2 pathway at early time points.

SOX9是肝祖細胞（LPCs）和膽管上皮細胞的特異性marker，激活NOTCH信號通路可以調控其表達，從而調控成肝細胞向膽管細胞（BDCs）分化。結果顯示，正常肝臟僅BDCs表達SOX9，但肝損傷組織的BDCs和包裹壞死組織的細胞在損傷后48-72h均表達SOX9（圖2A-B，原文將SOX9和肝細胞、LPCs以及BDCs的特異性marker進行了共染，僅肝細胞和BDCs與SOX9存在共定位）。由于MoMFs和SOX9+肝細胞共定位，作者在注射ConA 8h后清除小鼠巨噬細胞，結果顯示，SOX9+肝細胞顯著減少（圖2B-C）。此外，敲除CCR2同樣使SOX9+肝細胞顯著減少，但敲除CX3CR1對其沒有影響（圖2D）。接著，作者對SOX9表達調控機制進行探究。分選MoMFs并對能誘導SOX9表達的因子進行檢測，NOTCH信號通路的配體JAG1在ConA處理后顯著增加，且NOTCH信號通路其它靶基因表達顯著增加（圖2E）。JAG1高表達在壞死包裹區(qū)免疫細胞和ConA處理小鼠SOX9+肝細胞周圍，在沒有損傷肝臟組織里的表達極弱（圖2F）。用RFP標記小鼠CCR2并注射ConA，結果顯示，RFP與CCR2有顯著共表達，且注射ConA后共表達細胞比例增加（圖2G）。隨后，作者用JAG1受體敲除小鼠進行驗證，敲除小鼠JAG1受體顯著降低SOX9+肝細胞數(shù)量（圖2H）。因此，MoMFs通過JAG1/NOTCH信號通路誘導SOX9+肝細胞生成并包裹壞死區(qū)。

圖2

3、SOX9+hepatocytes are derived from mature hepatocytes and limit liver injury by activating survival signaling without contributing to hepatocyte proliferation.

接著作者用Sox9 CreERTRosa26-EYFP報告小鼠對SOX9+肝細胞來源進行追溯（該示蹤小鼠能讓70%的CK19+表達EYFP，CK19+主要表達在BDCs、LPCs以及部分門靜脈周圍肝細胞）。注射ConA產(chǎn)生的SOX9+肝細胞不表達EYFP蛋白（圖3A）。作者接著用 AAV-TBG-Cre+Rosa-EYFP報告小鼠進行追溯（標記肝細胞）。注射ConA產(chǎn)生的SOX9+肝細胞表達EYFP蛋白（圖3B）。雖然有報道指出門靜脈周圍SOX9+肝細胞有更強的再生能力，但注射ConA產(chǎn)生的SOX9+肝細胞沒有增殖能力（圖3C）。相反，未損傷肝組織存在大量增殖活躍的肝細胞，表明SOX9-而非SOX9+肝細胞是替代壞死組織的主要肝細胞來源（圖3C）。接著作者探究了SOX9對壞死組織的影響。利用AAV8-TBG-Cre特異性敲除肝細胞的SOX9并注射ConA發(fā)現(xiàn)，敲除SOX9顯著擴大壞死區(qū)，肝細胞增殖顯著減少，血液ALT水平和小鼠死亡率顯著升高（圖3D-F）。SOX9如何影響肝細胞存活呢？作者檢測了STAT3磷酸化和BCL-xL兩個抗凋亡蛋白表達。包裹壞死區(qū)的SOX9+肝細胞表達pSTAT3和BCL-xL，敲除SOX9或者其上游NOTCH2則阻滯其表達（圖3G-H）。因此，SOX9+肝細胞來源于成熟肝細胞，它高表達抗凋亡蛋白因而具有很強的抗凋亡能力，從而抑制肝臟組織壞死。

圖3

4、aHSCs encapsulate the necrotic areas with strong cell contraction?signal activation during the resolution phase to promote necrotic? area?resolution?which?is?induced?by?MoMFs.

aHSCs和MoMFs是包裹壞死區(qū)的主要細胞，desmin+HSC表達高水平的α-SMA和BrdU，表明肝損傷后HSCs開始增殖且活化（圖4A）。此外，aHSCs（α-SMA+desmin+）高表達與收縮功能相關的活化YAP以及pMLC（圖4B）。通過激活pMLC引起HSCs收縮的ECE1蛋白在包裹區(qū)表達顯著增加，且壞死后期與MoMFs存在顯著共定位（圖4C）。那么aHSC的產(chǎn)生是否與MoMFs有關？敲除小鼠的CCR2使α-SMA+HSCs（aHSCs）顯著減少，但敲除CX3CR1則沒有影響（圖4D）。用clodronate去除MoMF顯著抑制壞死組織修復（圖4E-F）。因此，MoMFs和aHSCs組成的包裹結構對肝損傷修復非常重要，且MoMFs對aHSCs產(chǎn)生至關重要。

圖4

5、Identification of 2 clusters of necrosis-associated MoMF populations?by scRNA-Seq, including C1q+?MoMFs and Pdgfb+?MoMFs, and?hypoxia-driven C1q+?MoMFs facilitate?dead cell removal and promote liver lesion repair.

用單細胞測序對包裹壞死區(qū)的MoMFs亞群進行分析，結果顯示有兩群MoMFs細胞在處理后顯著增加（C1q+MoMFs和Pdgfb+MoMFs，圖5A）。C1q的主要功能是清除死細胞，Pdgfb的主要功能是促進HSCs生長和活化。作者對這兩群細胞的功能進行了驗證。因為C1q+MoMFs細胞表達C1q和Ctsb這些補體和蛋白酶，作者構建了C1q-/-小鼠/用Ctsb抑制劑處理小鼠。敲除Clq/抑制Ctsb顯著抑制壞死組織的修復（圖5B）。壞死區(qū)通常處于缺氧狀態(tài)，作者探究了缺氧與C1q+MoMFs形成的關系。結果顯示，MoMFs和壞死區(qū)的其它細胞均處于缺氧狀態(tài)，MoMFs的HIF1α（低氧激活的轉錄因子）顯著活化，但未損傷區(qū)Kupffer細胞的HIF1α卻未被激活（圖5C）。構建髓系細胞特異性敲除HIF1a（Hif1amye-/-）的小鼠并注射ConA發(fā)現(xiàn)，除了其經(jīng)典下游CTSB和ECE1表達顯著減少外，C1q、LGMN和MAFB（C1q上游分子）表達均顯著下調（圖5D）。用死肝細胞和/或HIF激動劑處理巨噬細胞，上述兩個細胞亞群的大部分特征基因表達顯著上調（圖5E）。此外，HIF1a敲除的MoMFs吞噬能力顯著下降，且髓系細胞特異性敲除HIF1a小鼠其肝壞死組織的修復顯著減慢（圖5F-G）。因此，作者驗證出C1q+MoMFs和Pdgfb+MoMFs兩個MoMFs亞群細胞參與肝壞死組織的修復，C1q+MoMFs的出現(xiàn)與組織缺氧有關，可以促進死細胞清除和組織修復。

圖5

6、PDGFB derived from MoMFs in necrotic area promotes HSC?activation and contraction, thereby accelerating liver lesion resolution.

接下來，作者對Pdgfb+MoMFs的功能進行了探討。Pdgfb+MoMFs表達高水平的PDGFB，而PDGF可以通過PDGFR激活HSCs。作者構建了特異性敲除髓系細胞PDGFB（Pdgfbmye-/-）以及HSC的PDGFRA（PdgfraHSC-/-）小鼠。敲除小鼠包裹壞死組織的結構中與MoMFs共定位的aHSCs顯著減少，Desmin+BrdU+的HSCs顯著減少（圖6A-B）。Pdgfbmye-/-和PdgfraHSC-/-小鼠注射ConA后，壞死區(qū)面積顯著增加（圖6C）。此外，Hif1amye-/-小鼠的PDGFb表達減少，表明低氧調控PDGFb表達（圖6D）。因此，Pdgfb+MoMFs可以激活HSCs，從而促進組織修復。

圖6

7、Aggregation of IBA1+MoMFs, SOX9+hepatocytes, and α-SMA+HSCs surrounding necrotic lesions is also detected in other liver-injury models.

為了證明“IBA+MoMF、SOX9+肝細胞和aHSCs相互作用促進肝損傷修復”的普適性，作者用肺炎克雷伯菌感染、缺血/再灌注以及具有肝臟毒性的藥物（CCl4和APAP）構建了肝損傷模型。肺炎克雷伯菌感染和缺血/再灌注誘發(fā)的肝損傷能觀察到明顯的IBA+MoMF、SOX9+肝細胞和aHSCs在壞死組織包裹區(qū)聚集，但CCl4和APAP卻沒有這個現(xiàn)象，作者推測是因為這類藥物主要靶向肝細胞，因而有不同的修復機制。因此，“IBA+MoMF、SOX9+肝細胞和aHSCs促進肝損傷修復”這一機制具有普適性。

圖7

Take-home message：

本文緊扣“肝損傷組織的快速消融和修復機制”，構建了大量敲除和示蹤轉基因小鼠，結合大量的免疫組化/免疫熒光等染色技術，在體內水平全面而確鑿的為自己的觀點提供了論據(jù)。從其模型動物的使用，以及對肝損傷修復過程參與細胞的推理可以看出，該課題組在此方向深耕多年（詳情見Bin?Gao老師簡歷頁https://irp.nih.gov/pi/bin-gao）。雖然實驗技術的使用略顯單調且很常見，但“好的科學問題+可信度高的實驗模型+“言簡意賅”的實驗技術驗證“所得出的實驗結果卻是最直接、可信度最高的。當然，能被選為JCI雜志的封面文章，充分體現(xiàn)了其發(fā)現(xiàn)的新穎性，以及對肝損傷修復相關研究的重大意義。