空間組學(xué)（Spatial Omics）技術(shù)在2022年被《Nature》雜志列為最值得關(guān)注的七大技術(shù)之一，被譽為“生命科學(xué)”的下一個風(fēng)口?？臻g組學(xué)是一個快速發(fā)展的動態(tài)領(lǐng)域，它盡可能地利用空間結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和組織中生物分子的位置、組織和功能來讓我們了解它們?nèi)绾蜗嗷プ饔貌Ⅱ?qū)動各種生物學(xué)功能。

目前空間轉(zhuǎn)錄組、空間蛋白組以及空間代謝組這三類空間組學(xué)技術(shù)已經(jīng)有了較多應(yīng)用。

下面小編針對以上三類空間組學(xué)技術(shù)給大家介紹一下市場上較成熟的產(chǎn)品。

01?空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)是將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織病理學(xué)結(jié)合，還原了組織中各個空間位點的細(xì)胞信息和基因表達(dá)信息，目前商業(yè)化比較成熟，市場占有率較高的有10x Genomic的Visium、Nanostring的DSP、華大基因的Stereo-seq。

10x Visium空間

10x Visium空間捕獲技術(shù)通過使用空間條形碼mRNA結(jié)合寡核苷酸為實驗提供基礎(chǔ)。mRNA分子獲得空間條形碼有兩種方法。

在新鮮冷凍組織中，組織被固定并透化以釋放與相鄰捕獲探針結(jié)合的RNA，從而捕獲基因表達(dá)信息。然后從捕獲的RNA合成cDNA，并制備測序文庫。

在FFPE組織中，利用RNA模板連接(RTL)，在此過程中，蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄組中特定于基因的成對探針與它們的基因靶標(biāo)雜交，然后相互連接。該組織被滲透，釋放配對的探針對，結(jié)合到載玻片上的捕獲探針，從而捕獲基因表達(dá)信息。然后合成cDNA，并制備測序文庫。

10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組捕獲區(qū)域 6.5 x 6.5mm 、spot數(shù)量約5000個 、spot直徑 55μm 、分辨率 100μm 、支持HE染色。

DSP

DSP技術(shù)是以探針作為基因檢測和定量手段。如下圖所示，DSP技術(shù)使用的探針主要由三個部分組成：

（1）探針序列，使探針可以與目標(biāo)mRNA進(jìn)行互補結(jié)合；

（2）索引序列，包含正向和反向PCR引物結(jié)合位點，用于NGS建庫過程中的序列擴增和接頭連接，14nt UMI序列用于探針豐度定量，12nt probe ID用于鑒定探針對應(yīng)的基因；

（3）UV連接點，連接探針序列和索引序列，并可在紫外照射的情況下斷開，釋放索引序列。

先進(jìn)行染色&孵育：展現(xiàn)切片的形態(tài)學(xué)特征，對感興趣的組織進(jìn)行ROI圈選，之后進(jìn)行 UV切割（即釋放RNA探針連接寡核苷酸標(biāo)簽序列），收集釋放的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行定量；對收集的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行PCR擴增建庫，加上測序接頭，通過UMI對標(biāo)簽去重，通過probe ID與探針文庫比對明確標(biāo)簽對應(yīng)的基因，最終完成表達(dá)定量。

DSP空間轉(zhuǎn)錄組染色區(qū)域36.3mm x 14.1mm(之后手動選擇分析區(qū)域）、分辨率在10μm、不支持HE染色，只支持熒光成像、多種切片ROI區(qū)域選擇策略。

Stereo-seq

該技術(shù)將包含隨機條形碼序列的 DNA 納米球(DNB)沉積在經(jīng)過光刻蝕刻的改性硅表面 (芯片) 上，該表面上刻有網(wǎng)格圖案的點陣列，DNB有效地?？吭谠撽嚵兄忻總€點的直徑約為220nm，中心到中心距離為500或715 nm。對陣列進(jìn)行顯微照相，與引物一起孵育并測序以獲得包含每個蝕刻 DNB的坐標(biāo)標(biāo)識(CID)的數(shù)據(jù)矩陣獲得位置信息通過與 CID 雜交，將分子標(biāo)識符(MID) 和含有polyT 序列的寡核首酸連接在每個點上。形成時空探針簇，這種基于 DNB的策略能夠以比任何其他先前方法高得多的密度生成包含條形碼探針的大型芯片。

將冷凍組織貼片、芯片上的探針簇捕獲組織 polyA 尾的RNA，這是通過將新鮮的氮冷凍組織切片加載到芯片表面原位實現(xiàn)的，然后進(jìn)行固定、透化，最后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。收集擴增的cDNA，用作文庫制備的模板，并與CID一起測序。

華大Stereo-seq捕獲區(qū)域10 x 10mm(支持定制) 、spot數(shù)量 約4x108個 、spot直徑 0.22μm 、分辨率 0.5μm、 不支持HE染色、只支持熒光成像。

Slide-tags技術(shù)

12月13日由哈佛研究團隊在nature上發(fā)表了“Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics”文章[1]，介紹了Slide-tags新技術(shù)，Slide-tags 提供了一個通用平臺，用于將已建立的單細(xì)胞測量與空間基因組結(jié)合。

研發(fā)團隊開發(fā)了密集排列的DNA條形碼的10μm微珠的空間索引陣列，在微珠與spatial barcode之間由一段能被光切割的光解連接器連接。將新鮮的冷凍組織切片覆蓋到陣列芯片上，然后通過“光”切割光解連接器，讓微珠上帶有光裂解空間條形碼的標(biāo)記細(xì)胞核。這樣，用我們已知位置空間條形碼“標(biāo)記”來自完整的新鮮冷凍組織切片的細(xì)胞核。然后切割分離細(xì)胞核，使用現(xiàn)有的單細(xì)胞方法對分離的細(xì)胞核進(jìn)行10x細(xì)胞核捕獲實驗。對測序結(jié)果進(jìn)行分析，并添加空間位置。

作者通過對成年和發(fā)育中的小鼠大腦、人類大腦皮層、人類扁桃體和人類黑色素瘤進(jìn)行分析，證明了Slide-tags適用于多種組織類型，能夠?qū)в锌臻g位置信息的細(xì)胞核導(dǎo)入snRNA-seq、snATAC–seq和TCR測序的標(biāo)準(zhǔn)工作流程中。Slide-tags也很容易集成到已建立的單細(xì)胞計算工作流程中，如拷貝數(shù)變異（CNV）推理。

Slide-tags能真正將單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合，通過單細(xì)胞、空間分辨、多模式能力來揭示細(xì)胞類型特異性的空間變化基因表達(dá)，空間情境化受體-配體相互作用，并檢查參與腫瘤微環(huán)境的遺傳和表觀遺傳因素。作者對Slide-tags未來研究方向是適用于DNA的分析，使額外的表觀遺傳修飾成為可能。

Slide-tags目前只能通過臨近組織切片進(jìn)行HE染色，不能在原組織切片上進(jìn)行HE染色，通過空間標(biāo)簽，模擬位置分布，10x單細(xì)胞捕獲效率是50%，一定程度上會丟失部分信息。

02?空間蛋白組學(xué)

蛋自質(zhì)作為生物體最終生命活動的執(zhí)行者，同時可以反向調(diào)控遺傳物質(zhì)，組織空間層面的蛋白定位表達(dá)譜對于解析組織微環(huán)境，診斷、預(yù)后以及精準(zhǔn)醫(yī)療都具有重要價值。

根據(jù)定量方法的不同空間蛋白組學(xué)技術(shù)可以分為三大類：基于熒光基團循環(huán)成像的CODEX，基于質(zhì)譜的MIBI-TOF和基于測序的DSP，MIBI可以同時檢測多達(dá)100種靶標(biāo)蛋白，但金屬同位素標(biāo)記成本高、儀器貴重。

CODEX

Akoya Biosciences 推出的支持超多蛋白檢測CODEX蛋白組學(xué)分析平臺 (CO-Detection by IndEXing)核心設(shè)計原理是每種抗體上標(biāo)記特異性寡核苷酸“條碼標(biāo)簽”(Barcode)， 而不是直接標(biāo)記熒光染料。成像所需的熒光染料是通過和Barcode互補的寡核苷酸序列特異性結(jié)合，使得CODEX突破可見光譜熒光成像通道數(shù)量的限制，輕松實現(xiàn)50種或更多蛋白指標(biāo)的同時檢測及分析。

CODEX系統(tǒng)中的熒光成像是通過循環(huán)圖像采集及最終整合實現(xiàn)的。在每一個圖像采集的循環(huán)中，系統(tǒng)可以檢測3種靶點蛋白及細(xì)胞核。加入3色熒光報告基團進(jìn)行抗體識別并結(jié)合到對應(yīng)的Barcode上，使得抗體和抗原結(jié)合的信息通過成像記錄。然后在溫和條件下，洗脫熒光標(biāo)記物，完成一個檢測循環(huán)。再進(jìn)入到下一個檢測循環(huán)，重復(fù)加入熒光標(biāo)記報告基團-顯色成像-洗脫，直到檢測完所有靶標(biāo)。經(jīng)過圖像處理后，同一張樣本切片上即可顯示出多達(dá)50種不同的靶標(biāo)的空間分布及相互位置關(guān)系。

MIBI-TOF

MIBI（多重離子束成像）使用使用金屬同位素標(biāo)記一抗，待標(biāo)記的一抗與組織孵育結(jié)合后，使用離子光束釋放抗體結(jié)合的同位素，然后通過TOF質(zhì)譜對同位素分子定性定量，最后，將檢測結(jié)果與單細(xì)胞分辨率圖像合并，以獲得空間蛋白表達(dá)譜[2]。

DSP空間蛋白組學(xué)技術(shù)原理同DSP空間轉(zhuǎn)錄組原理，只是將于RNA結(jié)合的探針換成與蛋白結(jié)合的探針。

DSP則可以自主選擇關(guān)注區(qū)域，針對性檢測目標(biāo)區(qū)域的蛋白表達(dá)特征，單個區(qū)域內(nèi)的分辨率可以達(dá)到5-10個細(xì)胞，其次，DSP的蛋白靶標(biāo)同樣在100種以上，捕獲區(qū)域大、蛋白靶標(biāo)多、樣本兼容性強、實用性更高，成熟兼容轉(zhuǎn)錄組，幫助我們從兩個層面解析組織空間異質(zhì)性，目前也只適用于人和小鼠。

03?空間代謝組學(xué)

代謝組位于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的下游，提供生物體的終端信息，傳統(tǒng)代謝組混樣后丟失了空間位置信息，不能確定樣本中代謝物的具體分布。

空間代謝組在代謝組的基礎(chǔ)上整合了質(zhì)譜成像（Mass Spectrometry Imaging，MSI）技術(shù)。質(zhì)譜成像以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，通過質(zhì)譜逐點掃描生物組織切片樣品，與專業(yè)圖像處理軟件結(jié)合，能夠準(zhǔn)確識別并定位多種代謝物在組織、細(xì)胞間的差異分布，同時獲得代謝物的種類和含量，可適用的樣本類型豐富，臨床組織、動物組織或是植物組織都能夠兼容，可應(yīng)用場景也非常廣泛，不管是探究動物組織中腫瘤或病變組織的代謝通路，檢測外源性藥物分子在組織內(nèi)的吸收/分布/代謝，和排泄、候選藥物評價，又或是對植物組織中的初級或次級代謝物進(jìn)行精準(zhǔn)定位，闡述重要功能代謝產(chǎn)物的生物合成，和轉(zhuǎn)運途徑、驗證功能基因等等，空間代謝組都是非常合適的選擇。

隨著時代的發(fā)展，需求的增加，技術(shù)革新永遠(yuǎn)在路上！

參考文獻(xiàn)

[1] Russell AJC, Weir JA, Nadaf NM, et al. Slide-tags: scalable, single-nucleus barcoding for multi-modal spatial genomics. Preprint.?bioRxiv. 2023;2023.04.01.535228. Published 2023 Apr 3. doi:10.1101/2023.04.01.535228 IF: NA NA NA

[2] Ji AL, Rubin AJ, Thrane K, et al. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma [published correction appears in Cell. 2020 Sep 17;182(6):1661-1662].?Cell. 2020;182(2):497-514.e22. doi:10.1016/j.cell.2020.05.039 IF: 64.5 Q1 B1

[3] Liu C, Qi K, Yao L, et al. Imaging of Polar and Nonpolar Species Using Compact Desorption Electrospray Ionization/Postphotoionization Mass Spectrometry.?Anal Chem. 2019;91(10):6616-6623. doi:10.1021/acs.analchem.9b00520 IF: 7.4 Q1 B