??在進(jìn)行上游的轉(zhuǎn)錄組分析后，我們會(huì)得到基因的計(jì)數(shù)文件。通過該文件，我們可以進(jìn)行下游的DEG分析，獲得不同樣本的差異表達(dá)基因，并可以將這些基因富集到不同的生物學(xué)過程。

??該文以DEseq2為例，進(jìn)行差異表達(dá)分析。參考RNA-seq(7): DEseq2篩選差異表達(dá)基因并注釋(bioMart)
??首先我們需要準(zhǔn)備兩個(gè)文件，一個(gè)是countData文件，另一個(gè)是colData文件。countData文件可以通過python或者R將每個(gè)樣本的基因計(jì)數(shù)信息mix到一起。colData文件可以只包括一種處理，列名和處理名可以自定義。注意，countData的行名和colData的列名要一致。
??當(dāng)我們拿到了這兩個(gè)文件，便可以進(jìn)行后續(xù)分析了。參考文章中的解釋已經(jīng)相當(dāng)全面，這里只針對(duì)我在學(xué)習(xí)過程中遇到的一些小問題進(jìn)行進(jìn)一步描述。

1 載入數(shù)據(jù)

> condition <- factor(c(rep("control",2),rep("treat",2)), levels = c("control","treat"))
# 在這串代碼中，可以設(shè)置多個(gè)處理，例如
# condition <- factor(c(rep("control",3),rep("treat1",3)， rep("treat2", 3)), levels = c("control","treat1","treat2"))
# 表示一個(gè)對(duì)照組，兩個(gè)處理組，分別為3次重復(fù)

3 總體結(jié)果查看

> resultsNames(dds)
> res = results(dds, contrast=c("condition", "control", "treat"))
# 該處可以手動(dòng)選擇要進(jìn)行展示的組，可以選擇control和treat1或treat2
# res = results(dds, contrast=c("condition", "control", "treat1/2"))
或
# res <- results(dds, name=paste("condition_treat2_vs_control", sep="", collapse = NULL))
# 該處引號(hào)內(nèi)名稱一定要與 resultsNames(dds) 結(jié)果保持一致
# 數(shù)據(jù)收縮，避免極端值對(duì)log2FC的影響
> res <- lfcShrink(dds, coef = paste("condition_treatment2_vs_control", sep="", collapse = NULL), type = 'apeglm', res = res)

??之后按照參考文章中的步驟進(jìn)行操作，我們便可以獲得差異表達(dá)的基因。
??拿到差異表達(dá)基因后，可以根據(jù)自己的需求進(jìn)行數(shù)據(jù)展示，這里參考RNA-Seq：差異表達(dá)分析及可視化
??同時(shí)，我們可以將這些差異基因進(jìn)行富集分析，觀察其所富集到的過程或途徑。在這里我們以clusterProfiler為例進(jìn)行富集分析。如果進(jìn)行非模式作物的分析的話，我們需要構(gòu)建該物種的OrgDB庫，參考文章生信 | 構(gòu)建物種的OrgDb，該文章的描述很全面，直接按照作者的代碼進(jìn)行操作即可。
??當(dāng)然，我們也可以通過網(wǎng)站進(jìn)行富集分析，例如g:Profiler，只需輸入差異基因的ID，選擇自己的物種即可。但注意，該網(wǎng)站的物種基因組版本可能不是最新的，要注意你的Gene_ID要與該網(wǎng)站的基因組版本一致，如果不一致的話需要進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換。我們可以借助兩個(gè)版本的基因組共線性文件進(jìn)行ID的轉(zhuǎn)換，自己寫一個(gè)腳本即可。構(gòu)建OrgDB需要較大的內(nèi)存，如果內(nèi)存不夠可以在服務(wù)器上運(yùn)行。在服務(wù)器上安裝R包可能會(huì)遇到一些問題，這里可以參考一下我遇到的情況，問題匯總（持續(xù)更新）。
??以上兩種方法均能滿足我們的需求。但是，對(duì)于沒有接觸過R語言的人則更推薦第一種方法。第一種方法得到結(jié)果之后直接丟到dotplot函數(shù)中即可或者完成度較高的圖，而第二種方法則需要自己畫圖，這對(duì)不會(huì)R語言的人還是不太友好的。
??至此，RNA-seq的上下游基本分析流程已經(jīng)總結(jié)完畢。
??我自己本身也是一名初學(xué)者，該文也是自己在學(xué)習(xí)的過程中的一個(gè)小總結(jié)，如有任何錯(cuò)誤也請(qǐng)各位大佬及時(shí)指出。