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聽張旭東老師的課

發(fā)展情形

• 蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)不成熟，費用高 → 大量做轉(zhuǎn)錄組學(xué)(間接)
• 表達芯片已經(jīng)大部分被轉(zhuǎn)錄組測序替代，表達芯片優(yōu)劣勢，有可能芯片上沒有

簡單的分析流程

測序數(shù)據(jù)(上百G) --標準分析(需要服務(wù)器)→ 表達矩陣(幾M) --數(shù)據(jù)挖掘(PC/R語言)→ 統(tǒng)計圖表(幾M)

表達數(shù)據(jù)挖掘

• 三張表

① 表達矩陣：每行一個gene,每列一個樣本sample（可以在GEO數(shù)據(jù)庫下載）

② 樣本信息表：每行一個樣本，每列一個表型特征（臨床信息、表型特征、生化指標等）

③基因信息表：每行一個基因，每列一個信息

• 研究目的
  大多數(shù)為找到表型背后的分子機制
• 注
  RNA測序數(shù)據(jù)與芯片測序數(shù)據(jù)可以合并分析，但不能直接合并，相當(dāng)于是個分析各的，再看兩個分析找到的規(guī)律是否一致

分析方法

尋找關(guān)鍵基因和關(guān)鍵樣本

• 差異表達分析：哪些基因在兩組樣本中有明顯表達差異？

  • 差異表達分析得到的表格中：
    FC(Folder change) 該基因在所檢測的兩組樣品中表達量相差多少倍
    log2FC
    Pval(P value) 假設(shè)檢驗
    Padj 多重假設(shè)矯正之后的P value → 矯正之后的P value小于0.05為有顯著差異
    • Questions
      ① 如何篩選差異基因，只用P value<0.05行不行？
      不行，還要FC>2 或 |log2FC|>1
      ② 該設(shè)計多少個生物學(xué)重復(fù)？
      最少3個，最好有7、8個
      ③ 是否生物學(xué)重復(fù)越多，鑒定到的差異表達基因就越多？
      是。重復(fù)越多，更多差異小的基因被識別
      ④ DESeq2 鑒定到500個差異基因，換edgeR有2000個，哪個對？
      都對，選擇合適的，不同算法模式不一樣，要選擇適合目標測序結(jié)果的差異表達分析模型。差異表達基因少可以考慮換個模型，換個算法。
  • 差異表達分析結(jié)果可視化
    • 火山圖 左上角、右上角差異越大
    • Heatmap 表達量矩陣可視化
    • Question
      ① 是否差異越大的基因越該重點關(guān)注
      否，很多是已經(jīng)研究透徹的基因；可能只是結(jié)果，不是原因
      ② 差異表達基因過多或過少該如何調(diào)整？
      差異表達分析的基礎(chǔ)是假設(shè)檢驗(t檢驗)，假設(shè)檢驗涉及到概率模型，有可能當(dāng)前假設(shè)的概率模型并不適合當(dāng)前實驗結(jié)果，可以選擇其他分析軟件，或調(diào)整參數(shù)，更換概率模型，從而達到這種目的。

• 樣本聚類分析：探索樣本之間的關(guān)系，鎖定關(guān)鍵樣本，之后再做差異分析。

  • 樣本間相關(guān)系數(shù)：用來描述樣本表達模式的相似程度
    組間差異大，組內(nèi)差異小 → 正常，反之，不正常，可能需要重做。
  • 基因間相關(guān)系數(shù)：找到與已知基因關(guān)聯(lián)基因
    表達模式相似的基因
  • 相關(guān)系數(shù)：三種常用計算方法
    Pearson相關(guān)系數(shù)
    Spearman相關(guān)系數(shù)
    Kendel相關(guān)系數(shù)
    通常會關(guān)心相關(guān)系數(shù)在0.75 - 1 之間的值
  • 注：
    性別 —— Kendel相關(guān)系數(shù)
    腫瘤分期 —— Spearman相關(guān)系數(shù)

• 聚類分析和WGCNA：探索基因與表型的關(guān)系

  • 基因與表型可以做相關(guān)性分析，但是對于一個表型，不止一個基因與之相關(guān)，因此采?。?對所有基因聚類 → 用聚類后的基因簇(cluster)與表型做相關(guān)性分析
  • WGCNA分析(加權(quán)共表達分析)
    ① 模塊構(gòu)建(基因聚類)
    ② 性狀與模塊相關(guān)分析 —— 篩選出與該表型相關(guān)的gene cluster —— 對于該性狀，cluster中的基因不是同等重要，用Cytoscape繪出網(wǎng)絡(luò)圖,確定在中心位置的為關(guān)鍵gene
    ③ 鑒定Hub基因
  • TOM矩陣(拓撲重疊矩陣)
  • 注
    大部分人該過程在PC上完成，因為很耗內(nèi)存，很多都不得不濾除一些差異很小的基因

• 主成分分析(PCA)

  • 聚類分析和主成分分析都是降維分析
  • 對原來數(shù)據(jù)進行PC線性變換，通過n個PC各項加權(quán)，將m項降維至n項(n<m)
  • 要考慮的問題：
    ① 哪個PC最能體現(xiàn)樣品的差異？
    ② 假如你關(guān)心某項功能，應(yīng)該重點關(guān)注哪個PC?
    ③ 重點關(guān)注哪個PC,可以完成聚類
  • 結(jié)果圖：
    hub PC：bioplot
    hub PC：表型關(guān)聯(lián)
    hub genes：loadings plot

功能分析

• 富集分析：差異基因是否顯著集中在某個功能分類上？
  • 功能分類：GO分類、Pathway分類
  • 富集分析結(jié)果
    GO分類ID
    Description 分類功能描述
    GeneRatio 差異基因中有多少富集在此pathway上
    BgRatio 背景，所有基因中有多少富集在此Pathway上
    Pvalue 比較以上兩者，得到Pvalue
    P.adjust P值矯正
  • 最佳實踐：通過ClusterProfiler軟件包做
• 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(PPI)
  • 通過已有數(shù)據(jù)庫查看基因是否有關(guān)聯(lián)

表達驗證

• 目的：驗證測序、芯片是否靠譜；測序樣本生物學(xué)重復(fù)數(shù)量少，可以在表達驗證掰回來，驗證時多點生物學(xué)重復(fù)，增強說服力。
• 方法
  qPCR驗證
  數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)驗證(腫瘤數(shù)據(jù)庫TCGA、正常人數(shù)據(jù)庫GTEx、將兩者結(jié)合在一起的數(shù)據(jù)庫)
• 功能：證明相關(guān)性，但還不能證明這些基因就有這個功能

功能驗證

• 實驗：
  敲除、敲低
  過表達
• 人類疾病：生存分析

分子機制

TCGA等多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析

• 序列變異
• 表觀遺傳修飾
• 轉(zhuǎn)錄調(diào)控