當(dāng)下的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，每年都會(huì)遭受來自生物或非生物脅迫帶來的損失。想要挽回?fù)p失，進(jìn)行作物抗性育種，就迫切需要理解植物對(duì)于外界脅迫的響應(yīng)。植物細(xì)胞內(nèi)NLR蛋白是一類識(shí)別病原微生物效應(yīng)因子的受體，對(duì)植物免疫病原物起著至關(guān)重要的作用。然而NLR蛋白在單雙子葉植物中數(shù)量和種類分布差異巨大，例如單子葉NLR蛋白中TNL的缺失。更有趣的是，NLR信號(hào)下游的成分NDR1和EDS1-PAD4-SAG101復(fù)合物不僅能參與免疫通路，還能夠調(diào)控非生物脅迫。那么NLR蛋白是否可以介導(dǎo)生物和非生物脅迫串?dāng)_呢？ 本文從比較基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)給出了答案。
文章信息
- 題目：Convergent Loss of an EDS1/PAD4 Signaling Pathway in Several Plant Lineages Reveals Co-evolved Components of Plant Immunity and Drought Response
- 期刊和時(shí)間：The Plant Cell，2020.7
- 作者和單位：通訊作者來自加州大學(xué)伯克利分校Ksenia V. Krasileva副教授。
主要結(jié)果
- 利用比較基因組學(xué)檢索了被子植物NLR蛋白的拷貝數(shù)變異和多樣性。
- 檢索了上述植物中EDS1/PAD4通路關(guān)鍵蛋白的分布。
- 利用基因家族聚類方法預(yù)測(cè)了與EDS1/PAD4通路關(guān)鍵蛋白共進(jìn)化的NLR蛋白。
研究結(jié)果
1.有花植物的NLR拷貝數(shù)變異巨大
作者首先利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome，COGE，KEGG，NCBI，Maize GDB，Ash Tree）獲取到95個(gè)被子植物基因組并且調(diào)查了它們的NLR拷貝數(shù)（Fig1）。注釋文件顯示大部分已測(cè)序的基因組具有200-500個(gè)NLR。作者在各個(gè)科中根據(jù)其NLR多樣性和基因組組裝質(zhì)量，選擇了18個(gè)單雙子葉的代表物種并繪制了全基因組物種系統(tǒng)發(fā)育樹（Fig2）。
在兩張圖中，作者使用了Amborellales基因組的NLR數(shù)量作為單雙子葉的對(duì)照。無油樟目（Amborellales）是被子植物的一個(gè)目，僅含無油樟科（Amborellaceae）一個(gè)科。APG IV系統(tǒng)認(rèn)為無油樟目是被子植物基部群的三個(gè)目之一，也是被子植物的最早期分支。在后面的系統(tǒng)發(fā)育樹中也起到了外群的作用。
注解：Fig2是18個(gè)代表物種的全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹。枝上標(biāo)注了NLR基因獲得（黑色數(shù)字）和缺失數(shù)（紅色數(shù)字）。這兩個(gè)數(shù)字通過系統(tǒng)發(fā)育樹協(xié)調(diào)（Tree Reconciliation）方法計(jì)算得出，更多有關(guān)信息可以參考這篇文章：Phylogenetic Tree Reconciliation: Mean Values for Fixed Gene Trees。該方法可用于計(jì)算基因進(jìn)化史和物種進(jìn)化史的不一致程度，從而計(jì)算基因的獲得數(shù)和缺失數(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹拉丁名后面的兩個(gè)數(shù)分別是用PfamScan和plant_rgenes預(yù)測(cè)的（括號(hào)里的）帶有關(guān)鍵motif的NLR數(shù)量。
在物種水平查看了NLR基因的收縮和擴(kuò)張之后，作者著手關(guān)注單一NLR在各個(gè)物種中的分布。同時(shí)具有六種功能motif的NLR蛋白的NB-ARC域被選擇構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Fig3）。作者單獨(dú)放大了TNL和RNL枝（藍(lán)色框和紅色框）。同時(shí)作者給出了系統(tǒng)發(fā)育樹中基因擴(kuò)張的例子（灰色框），可見某一物種如果在某一進(jìn)化枝中大量富集，這種模式出現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹中就是串聯(lián)重復(fù)基因擴(kuò)張。 以此為據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)NRG1集中出現(xiàn)在TNL擴(kuò)張的群體中，因?yàn)門NL依賴NRG1傳遞信號(hào)。S.polyrhiza, Z. marina, and U. gibba三種物種中有很高比例的NLR蛋白以單系種特異群形式出現(xiàn)，也就是說在這三個(gè)物種中一個(gè)NLR蛋白形成的進(jìn)化枝中同一個(gè)物種不會(huì)出現(xiàn)兩次。而其中S.polyrhiza, Z. marina也發(fā)現(xiàn)了部分串聯(lián)重復(fù)基因擴(kuò)張的例子，說明盡管二者跟其他物種相比丟失了一些基因，但是剩余的基因仍然再進(jìn)行種內(nèi)擴(kuò)張。
2.免疫信號(hào)EDS1/PAD4/SAG101在被子植物的丟失
利用tblastn和blastp方法，作者繼續(xù)探究了免疫信號(hào)下游組分的出現(xiàn)與否（Fig4是95個(gè)物種的信號(hào)分布情況）。有意思的一點(diǎn)，U. gibba物種在剛剛我們見識(shí)到了它NLR基因喪失的很嚴(yán)重，種內(nèi)串聯(lián)重復(fù)擴(kuò)張也沒有。但是其SA通路仍然保留，說明了SA通路在植物免疫中的重要地位。丟啥也不能丟SA（這部分信息在Supplemental Table 4）。
Fig4中出現(xiàn)的幾個(gè)免疫信號(hào)下游組分，都是研究中經(jīng)常出現(xiàn)的熱點(diǎn)。新手小伙伴可以自行查閱：
RPM1 INTERACTING PROTEIN 4 (RIN4)
MAP KINASE 4 (MPK4)
ISOCHORISMATE SYNTHASE 1 (ICS1)
METACASPASE 4/ 5 (MCP4/5)
REQUIRED FOR MLA12 RESISTANCE 1 (RAR1)
同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)在一些沒有RNL和TNL的物種中，EDS1/PAD4/SAG101免疫組分也有丟失。因此作者擴(kuò)大范圍，回到原有的95個(gè)物種中調(diào)查EDS1/PAD4/SAG101免疫組分的丟失情況（Fig4）。同樣發(fā)現(xiàn)在NLR蛋白少的物種中免疫組分EDS1/PAD4/SAG101和RNL會(huì)丟失，這些免疫組分不僅是蛋白互作物，也是進(jìn)化單元。
丟失基因的遺傳區(qū)域結(jié)構(gòu)對(duì)于理解基因何時(shí)丟失以及如何丟失非常重要，因此作者對(duì)A. comosus 和S.polyrhiza染色體區(qū)域的EDS1，PAD4和ADR1及其他同源基因進(jìn)行了同線性分析（Fig5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAD4 和ADR1都能找到物種間的通線性區(qū)域，而EDS1找不到該區(qū)域?；騺G失可能是刪除所導(dǎo)致的。
3.正交同源蛋白家族分析尋找趨同丟失的基因
NLR基因和EDS1/PAD4/SAG101的趨同丟失使作者聯(lián)想到可能存在其他趨同丟失的基因，那么應(yīng)該如何找到這些趨同丟失的基因呢？因此作者測(cè)定了18個(gè)代表物種的蛋白質(zhì)組并進(jìn)行了正交組分析（Orthogroup Analysis）。正交組分析依靠?jī)蓚€(gè)關(guān)鍵手段：OrthoMCL分析和GeneSeqToFamily分析，從而將蛋白質(zhì)聚類到正交組，完成基因丟失的歸類。
通過結(jié)合單子葉和雙子葉OrthoMCL分析（Fig6），作者在4個(gè)丟失EDS1、PAD4和RNL基因的物種中鑒定出了17個(gè)缺少同源類群的擬南芥基因。 GeneSeqToFamily使作者從10個(gè)正交群中候選出31個(gè)擬南芥基因。兩種方法取交集從而確定了四種基因，前三種就是剛剛發(fā)現(xiàn)的EDS1，PAD4，ADR1（RNL）。還有一種REGULATOR OF CHROMOSOME CONDENSATION 1- LIKE(RCC1-like)是之前沒有發(fā)現(xiàn)的蛋白。 進(jìn)一步作者檢索了兩個(gè)方法中任意一個(gè)檢測(cè)出來的蛋白，在EDS1缺失物種中一共找到了51個(gè)候選蛋白，并將其命名為ASTREL。
4.擬南芥和水稻中ASTREL基因應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫時(shí)的差異應(yīng)答
為了了解ASTREL基因是否在生物脅迫或其他途徑中存在差異表達(dá)，作者尋找了ASTREL共表達(dá)模式。通過mRNaseq和microarray技術(shù)進(jìn)行抗性擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物脅迫和非生物脅迫（干旱）對(duì)ASTREL表達(dá)有不同的調(diào)控方式。生物脅迫和非生物脅迫可影響ASTREL基因的共表達(dá)。
總結(jié)：
本文是一篇針對(duì)基因組和同源蛋白家族分析的純生信文章，其中正交組實(shí)驗(yàn)用來尋找趨同丟失基因讓人耳目一新，或許可以借鑒到未來的研究中。此外，文章的立意十分有趣，結(jié)合了生物和非生物抗性講出了一個(gè)有意思的故事，是比較基因組，系統(tǒng)發(fā)育和基因趨同進(jìn)化領(lǐng)域一個(gè)可借鑒的研究模板。
1. Erin L. Baggs, J. Grey Monroe, Anil S. Thanki, Ruby O’Grady, Christian Schudoma, Wilfried Haerty, Ksenia V. Krasileva, Convergent Loss of an EDS1/PAD4 Signaling Pathway in Several Plant Lineages Reveals Coevolved Components of Plant Immunity and Drought Response, The Plant Cell, Volume 32, Issue 7, July 2020, Pages 2158–2177, https://doi.org/10.1105/tpc.19.00903
2. Górecki, P., Markin, A., Mykowiecka, A., Paszek, J., Eulenstein, O. (2017). Phylogenetic Tree Reconciliation: Mean Values for Fixed Gene Trees. In: Cai, Z., Daescu, O., Li, M. (eds) Bioinformatics Research and Applications. ISBRA 2017. Lecture Notes in Computer Science(), vol 10330. Springer, Cham. https://doi.org/10.1007/978-3-319-59575-7_21
