本文選自Nature communication，https://doi.org/10.1038/s41467-020-14332-x，喜歡的朋友可以自行下載。
最近和nature communication干上了，不要見怪。
以前看的也就是Treg CTL MDSC，今天來看看NKT.其實(shí)，NKT是機(jī)體固有免疫的重要組成部分。這個(gè)和NK細(xì)胞還不太一樣。NKT細(xì)胞能表達(dá)T細(xì)胞的TCR與NK細(xì)胞的NKR-P1兩種受體，特別是NKT細(xì)胞多數(shù)表達(dá)Va14TCR，識(shí)別CD1抗原，而NKR-P1識(shí)別各種糖鏈，?NKT細(xì)胞，特別是CD4-NKT細(xì)胞，對(duì)TCR刺激可產(chǎn)生大量IL-4及IFNγ,同時(shí)具有ThO型細(xì)胞因子產(chǎn)生能力。NKT細(xì)胞不但是產(chǎn)生IL-4的主要細(xì)胞，而且強(qiáng)力產(chǎn)生IFNγ。IFNγ參與自身Th1誘導(dǎo)，具有極強(qiáng)的Th1誘導(dǎo)能力，從而是IL-2產(chǎn)生亢進(jìn)。它同時(shí)還具有Th2細(xì)胞分化抑制功能。IL-12能誘導(dǎo)NKT細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。IL-12對(duì)TCR的刺激是IFNγ的產(chǎn)生顯著亢進(jìn)。
主要特征：1.共表達(dá)T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞受體。經(jīng)典NKT細(xì)胞一般為CD4+和DN NKTNKT細(xì)胞。其中NK1.1是NKT細(xì)胞最主要的表面標(biāo)記。
2.TCR基因偏向性取用(bias usage)。與其它T細(xì)胞亞群相比，NKT細(xì)胞具有獨(dú)特的限制性表達(dá)TCR庫(kù)。
3.接受CD1d遞呈的脂類抗原，在固有免疫中發(fā)揮作用。
功能：主要包括免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒作用，NKT細(xì)胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4,IFN-γ，GM-CSF,IL-13和其它細(xì)胞因子和趨化因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，NKT細(xì)胞是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一。NKT細(xì)胞活化后具有NK細(xì)胞樣細(xì)胞毒活性，可溶解NK細(xì)胞敏感的靶細(xì)胞，主要效應(yīng)分子為穿孔素，F(xiàn)as配體以及IFN-γ。
由于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞都能分泌細(xì)胞因子促進(jìn)自身的增殖并抑制對(duì)方的增殖，因此在正常情況下機(jī)體中 Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡的狀態(tài)。但當(dāng)機(jī)體發(fā)生功能異常時(shí)，常表現(xiàn)出平衡偏向其中一方，稱為 “Th1/Th2漂移”。一旦Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞之間的平衡狀態(tài)被打破，很可能造成人體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，進(jìn)而引起許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展。
本文報(bào)道iNKT細(xì)胞活化后脂質(zhì)生物合成增加，PPARγ和PLZF通過增強(qiáng)Srebf1的轉(zhuǎn)錄協(xié)同促進(jìn)脂質(zhì)生物合成。在這些脂質(zhì)中，膽固醇是iNKT細(xì)胞產(chǎn)生最佳干擾素-γ所必需的。腫瘤微環(huán)境中的乳酸減少瘤內(nèi)iNKT細(xì)胞PPARγ的表達(dá)，從而降低其膽固醇合成和干擾素-γ的產(chǎn)生。
iNKT細(xì)胞既可以通過抗原識(shí)別直接殺傷腫瘤細(xì)胞，也可以通過耗盡腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)，促進(jìn)NK和CTLs1-4的活化來增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，
作者檢測(cè)到在分離的小鼠iNKT細(xì)胞(補(bǔ)充圖1)中，與傳統(tǒng)的CD_8+和CD_4+T細(xì)胞相比，PPARγ(圖1A)的水平更高，這是一種眾所周知的脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子。這個(gè)INKT的MARKER是什么？（CD69和CD25）而且用發(fā)現(xiàn)抗CD3+抗CD28刺激顯著增加了細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量,PPAR激動(dòng)劑PIO,T007就是他的拮抗劑。
作者進(jìn)一步看了看PPAR下游關(guān)于脂質(zhì)合成一些基因表達(dá)情況。如果作者不是為了做下游我覺得這些個(gè)基因都可以不做，知道表型同樣可以說明問題。
這種免疫細(xì)胞重要的還是功能，前面可以知道T細(xì)胞發(fā)揮功能最主要就是生成干擾素和腫瘤壞死因子，看一波功能再說。作者用了脂質(zhì)合成的抑制劑TOFA,PPAR另一種抑制劑GW9662(為什么搞這么多抑制劑。）發(fā)現(xiàn)了INKT細(xì)胞IL-4影響較小，對(duì)IFN-γ和IFN-g影響較大。說明這個(gè)使免疫功能偏向了TH2 CD4+T細(xì)胞。作者用了INKT的另一種激動(dòng)劑α-GC，在體內(nèi)驗(yàn)證了這兩種拮抗劑抑制INKT的作用。既然這些拮抗劑對(duì)干擾素作用比較大，而且干擾素和脂代謝相關(guān)，那么作者下面就著重看了這個(gè)問題。
作者在細(xì)胞內(nèi)Sh了PPAR，看看INKT的功能變化，條件敲除INKT的PPAR,進(jìn)行了功能分析。發(fā)現(xiàn)抑制了INKT的脂代謝也抑制了其功能。其實(shí)條件敲除說理性還是挺高的。然我想起了那個(gè)CD36，組會(huì)討論說了這個(gè)全身用針對(duì)這些靶點(diǎn)的拮抗劑不會(huì)對(duì)其他器官功能產(chǎn)生影響嗎？可能作者壓根就不關(guān)心這個(gè)問題。好用就行。
有研究表明脂肪酸β氧化可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，作者驗(yàn)證了，但是沒有影響INKT。
以往的研究結(jié)果表明，某些飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸在T細(xì)胞活化作用中起著重要的作用，作者又懂了脂肪酸的歪點(diǎn)子。分別加一加看看。握草，這不是和我前段時(shí)間看的那個(gè)CD36差不多嘛，那里沒有解釋為什么脂質(zhì)會(huì)活化Treg。有點(diǎn)搞頭??！飽和和不飽和脂肪酸，包括辛酸、癸酸、棕櫚酸、油酸、亞麻酸和亞油酸，都不能恢復(fù)干擾素-γ的產(chǎn)生(圖3A)。高濃度的棕櫚酸、油酸和亞油酸甚至減少了干擾素-γ的產(chǎn)生(圖3A)，這可能是由于細(xì)胞凋亡增加所致。相反，補(bǔ)充水溶性膽固醇成功地恢復(fù)了干擾素-γ的產(chǎn)生。握草，膽固醇，這不是他汀藥物的靶點(diǎn)嗎。
膽固醇先前已被證明調(diào)節(jié)TCR信號(hào)。在作者的研究中，當(dāng)pMA+離子霉素繞過tcr信號(hào)被iNKT細(xì)胞激活時(shí)，外源膽固醇、C75和TofA對(duì)干擾素-γ的產(chǎn)生沒有影響。
作者進(jìn)一步看了看看INKT表面的TCR表達(dá)情況。
以上說明了膽固醇提高了TCR參與了INKT的激活。在PPARγ調(diào)控的基因中，Srebf1編碼甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)，它是調(diào)節(jié)脂質(zhì)生物合成的主要轉(zhuǎn)錄因子。SREBP家族包含SREBP1和SREBP2，這里只有SREBP1受影響。這個(gè)軸目前逐漸清晰PPAR-SREBP1-膽固醇、干擾素
作者進(jìn)一步看看PPAR調(diào)控SREBP1的方式，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄和翻譯水平都受到影響，所以，作者從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，用到染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，表明PPAR可以結(jié)合到SREBP1的啟動(dòng)子區(qū)域，PPARγ的拮抗劑不影響CD4+T和CD8+T細(xì)胞中成熟或不成熟SREBP1的數(shù)量或總SREBP1蛋白，這些結(jié)果表明，PPARγ以一種細(xì)胞類型特異性的方式調(diào)節(jié)SREBP1mRNA的表達(dá)，這里找到INKT和一般T細(xì)胞的代謝異同點(diǎn)可能就解決了PPAR和SREBP1的關(guān)系。
PLZF是一種細(xì)胞類型特異性的主調(diào)控因子，控制iNKT細(xì)胞的發(fā)育和效應(yīng)功能，在傳統(tǒng)的T細(xì)胞中不表達(dá)。在與PPARγ共沉淀的蛋白中檢測(cè)到PLZF，iNKT細(xì)胞的激活進(jìn)一步促進(jìn)了PPARγ與PLZF的結(jié)合，盡管PPARγ的拮抗劑和激動(dòng)劑不影響這兩種蛋白的結(jié)合，此外，在激活iNKT細(xì)胞后，觀察到PLZF和PPARγ之間的共定位增加
PIO和T007對(duì)共定位系數(shù)沒有影響。這些結(jié)果表明，PPARγ與PLZF之間的相互作用是由激活信號(hào)控制的，而不是由PPARγ的配體控制的，接下來，作者研究了PPARγ是否需要plzf來促進(jìn)Srebf1的轉(zhuǎn)錄。PPARγ有兩種亞型，PPARγ1和PPARγ2。在iNKT細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)到Pparg1和Pparg2mRNA，本研究中使用的抗PPARγ抗體不能區(qū)分PPARγ1和PPARγ2。PPARγ和PLZF在小鼠和人之間是保守的(同源性分別為96%和97%)。因此，作者分別在人293T細(xì)胞中過表達(dá)了小鼠PPARr1和PPARr2以及聯(lián)合或不聯(lián)合表達(dá)PLZF，共表達(dá)PPARPLZF2和γ顯著增加了成熟SREBP1的數(shù)量，總SREBP1蛋白和Srebf1mRNA。如果是做的分?jǐn)?shù)比較高的文章，對(duì)亞型的判斷會(huì)更加精細(xì)，所以說，如果想要把某一個(gè)東西研究的很透徹，必須要關(guān)注這些亞型，可能也是提分的關(guān)鍵。
綜上所述，PPARγ2需要PLZF才能結(jié)合到Srebf1的啟動(dòng)子區(qū)域并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。與iNKT1亞群相比，表達(dá)PLZF和PPARγ含量較高的iNKT2和iNKT17亞群顯示出更高的SREBP1和膽固醇含量。這個(gè)細(xì)胞的亞群也挺有意思。查了一下這個(gè)NKT細(xì)胞是國(guó)人發(fā)現(xiàn)的一種特殊的免疫細(xì)胞，但是在10年左右的事情了。
作者作了這么多，也只是說明了NKT細(xì)胞的功能作用，在腫瘤中發(fā)揮什么作用，又是怎么失位的呢？提一波腫瘤中的NKT看看。瘤內(nèi)人iNKT細(xì)胞顯著減少干擾素-γ的產(chǎn)生，
為了證明腫瘤內(nèi)iNKT細(xì)胞的功能障礙是由于膽固醇合成受損，在腫瘤浸潤(rùn)的iNKT細(xì)胞中加入水溶性膽固醇，發(fā)現(xiàn)它成功地恢復(fù)了干擾素-γ的產(chǎn)生，應(yīng)用PPAR激動(dòng)劑，同樣得到一致結(jié)論。這些結(jié)果表明，PPARγ的減少導(dǎo)致人類腫瘤浸潤(rùn)的iNKT細(xì)胞膽固醇合成受損和功能障礙，而這種功能可以通過PIO恢復(fù)。
腫瘤浸潤(rùn)NKT細(xì)胞其實(shí)功能受到抑制，下面的實(shí)驗(yàn)其實(shí)就是老套路了，用藥物恢復(fù)NKT的功能，看看抗腫瘤效應(yīng)。鼠哥上場(chǎng)了。在動(dòng)物上完全模擬了人組織標(biāo)本的結(jié)果。腫瘤微環(huán)境富含乳酸，先前已經(jīng)證明乳酸可以抑制iNKT細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ。作者用的是脾臟的NKT細(xì)胞對(duì)照的。下面的都是上述實(shí)驗(yàn)的重復(fù)驗(yàn)證環(huán)節(jié)。
為了測(cè)試PIO能否在體內(nèi)恢復(fù)瘤內(nèi)iNKT細(xì)胞功能，B16F10黑色素瘤荷瘤小鼠每天經(jīng)口灌胃PIO7天，然后腹腔注射iNKT細(xì)胞特異性抗原αGC(圖6E)。PIO激活后可增加腫瘤浸潤(rùn)性iNKT細(xì)胞中SREBP1的表達(dá)和膽固醇的合成(圖6f，g)。因此，PIO處理顯著增加了iNKT瘤內(nèi)αGC誘導(dǎo)的干擾素-γ的產(chǎn)生(圖6H)。此外，PIO處理在體外促進(jìn)了腫瘤浸潤(rùn)性iNKT細(xì)胞突觸TCR的積累和突觸的形成(圖6I-K)。
開始腫瘤治療方面的應(yīng)用了。雖然PIO不能完全恢復(fù)瘤內(nèi)iNKT細(xì)胞的脂質(zhì)合成和干擾素-γ的產(chǎn)生(圖6H)，但腫瘤內(nèi)干擾素-γ的增強(qiáng)表明有更好的抗腫瘤反應(yīng)。與恢復(fù)腫瘤浸潤(rùn)性iNKT細(xì)胞中干擾素-γ的產(chǎn)生一致(圖6H)，PIO治療顯著促進(jìn)了iNKT細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫療法對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞的療效。由前面的內(nèi)容可以知道干擾素可以激活CTL細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫功能。
在iNKT細(xì)胞缺陷的Jα18?/?小鼠和IFNG?/?小鼠中，PIO和CD8GC的聯(lián)合對(duì)腫瘤大小、瘤內(nèi)NK細(xì)胞和α+T細(xì)胞的頻率及其干擾素-γ的產(chǎn)生沒有影響(圖7g-k)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PIO+αGC增強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答依賴于iNKT細(xì)胞和干擾素-γ的產(chǎn)生。
我上篇怎么說來著，雙向的骨髓移植，這個(gè)我們之前很多文獻(xiàn)都說過這個(gè)問題了，可以這么說，只要做到免疫，這個(gè)不是必須那也是多少要沾邊的。不說了，直接上圖。
本文結(jié)束了，文章還是挺不錯(cuò)的，機(jī)制和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都很好，正反驗(yàn)證以及rescue實(shí)驗(yàn)做的也不錯(cuò)，有很多值得借鑒之處。歡迎批評(píng)、指正。
