陳巍學(xué)基因-illumina測(cè)序原理
官方-illumina測(cè)序原理
步驟：
一、sample prep（樣本準(zhǔn)備）：基因文庫制備（一個(gè)基因組切斷再加接頭）
二、cluster generaton（簇的形成）：文庫在測(cè)序芯片（流動(dòng)池flowcell）上不斷擴(kuò)增，形成橋式PCR，再切掉反向鏈（reverse strand），形成許多簇相同的正向序列（正向鏈forward strand）。
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三、sequencing（測(cè)序）：熒光信號(hào)、可逆阻斷終止技術(shù)、Sequences-by-Synthesis
四、data analysis（數(shù)據(jù)分析）
具體內(nèi)容：
一、基因文庫：
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- 接頭不僅含有與測(cè)序芯片上互補(bǔ)的序列，有時(shí)還有index序列，由于測(cè)序芯片的強(qiáng)大，一個(gè)芯片可以同時(shí)測(cè)許多樣本（動(dòng)物、植物、微生物），那如何區(qū)分測(cè)序數(shù)據(jù)來自哪個(gè)樣本呢？加標(biāo)簽即加index序列，從而來區(qū)分不同的樣本。
二、橋式PCR：文庫種到測(cè)序芯片，并進(jìn)行擴(kuò)增的過程。
測(cè)序芯片：
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- 形成簇之后，加入帶不同熒光標(biāo)記的dNTP（含有疊氮基團(tuán)）和聚合酶，使得帶熒光標(biāo)記的dNTP結(jié)合到測(cè)序鏈上，再進(jìn)行激光掃描，得到熒光，推出結(jié)果。堿基結(jié)合到測(cè)序鏈并發(fā)出熒光信號(hào)的過程被稱為Sequences-by-Synthesis。
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- 由于疊氮基團(tuán)的存在（可逆阻斷終止技術(shù)），一個(gè)循環(huán)只能延長一個(gè)堿基，即一個(gè)堿基結(jié)合到測(cè)序鏈上為一個(gè)循環(huán)，當(dāng)結(jié)合上一個(gè)堿基后，把其他dNTP和酶用水沖掉，然后進(jìn)行激光掃描，根據(jù)激光掃描顏色判斷是哪個(gè)堿基，根據(jù)互補(bǔ)原則反推出結(jié)果，再切掉疊氮基團(tuán)，進(jìn)入新的循環(huán)，加入新的dNTP和酶，再延長堿基，沖掉dNTP和酶，再激光掃描。
- 讀取index（Barcode）: 和讀取測(cè)序鏈一樣的原理，讀取的目的是為了確定樣本的來源。
三、雙末端測(cè)序：即對(duì)正向鏈測(cè)序也對(duì)反向鏈測(cè)序。
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