1.細(xì)菌污染的特征
細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染，其污染主要來源于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)服、實(shí)驗(yàn)耗材、共用試劑等，甚至在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加雙抗，也經(jīng)常因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽?/p>
很多實(shí)驗(yàn)人員容易將細(xì)菌和“黑膠蟲”區(qū)分不清，極易造成污染種類判斷錯(cuò)誤而“延誤病情”，“黑膠蟲”是一種常見的細(xì)胞污染物，與細(xì)胞競爭性生長，對細(xì)胞生長不利，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前很多細(xì)胞存在被“黑膠蟲”污染的現(xiàn)象，對細(xì)胞培養(yǎng)及其后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成了極大地影響。
“黑膠蟲”污染與細(xì)菌污染最明顯的一個(gè)差別就是：“黑膠蟲”污染的培養(yǎng)基不渾濁，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞周圍和培養(yǎng)液中有“黑膠蟲”呈現(xiàn)布朗運(yùn)動(dòng)。細(xì)菌污染在1~2后會出現(xiàn)渾濁、PH下降變黃，污染初期培養(yǎng)基肉眼觀察無明顯改變，只有在倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察才能發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)“一穿而過”的細(xì)菌，所以需要實(shí)驗(yàn)員每天細(xì)心觀察才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染，一般細(xì)菌污染進(jìn)程很快，有的細(xì)胞在培養(yǎng)箱過夜后肉眼就能顯著觀察到渾濁，在顯微鏡下可以觀察到黑點(diǎn)在培養(yǎng)基內(nèi)游動(dòng)，細(xì)胞變圓或者崩潰，從壁上脫落死亡。
2.清除細(xì)菌污染操作規(guī)程
從-20℃冰箱內(nèi)取出細(xì)菌清除劑，將試劑管瞬時(shí)離心（3000rpm，3~5s）后放置于EP管架上，用75%的酒精噴灑試劑管的表面，在生物安全柜中進(jìn)行無菌操作；
以T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶為例
對于培養(yǎng)基中有偶有黑點(diǎn)穿過但未見明顯渾濁的細(xì)胞，處于細(xì)菌污染初期，需要立即更換為含有細(xì)菌清除劑的完全培養(yǎng)基，通常推薦使用的稀釋倍數(shù)為2000×，如：6mL的完全培養(yǎng)基加入3μL的細(xì)菌清除劑混勻，連續(xù)加藥培養(yǎng)1~2周即可有效清除細(xì)菌污染。
對于培養(yǎng)基突然變黃并明顯沙化渾濁的細(xì)胞，此時(shí)細(xì)菌污染已非常嚴(yán)重，需要酌情增加藥物濃度以提高清除細(xì)菌的效率，建議提高至1000×濃度進(jìn)行清除，如：6mL的完全培養(yǎng)基加入6μL的細(xì)菌清除劑混勻。每天換液兩次，建議上午進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行一次加藥培養(yǎng)基換液，下午離開實(shí)驗(yàn)室之前進(jìn)行一次加藥培養(yǎng)基換液，第二天和第三天重復(fù)此過程，第四天開始即可每天換液一次，連續(xù)加藥培養(yǎng)1~2周（或傳代3次）后，無菌檢測判斷是否還存在細(xì)菌污染。
注意：
① 貼壁細(xì)胞換液或傳代前，棄去舊的培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞表面2次。
② 若細(xì)胞達(dá)到可傳代比例，請及時(shí)傳代并鋪入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，換新瓶的過程也可有效規(guī)避培養(yǎng)瓶壁上殘留細(xì)菌的污染；
③ 細(xì)菌清除干凈后，必須進(jìn)行傳代并鋪入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，且在新瓶中加藥維持1~2天后，才可以撤掉細(xì)菌清除劑，避免在舊瓶中撤藥后舊瓶壁上的細(xì)菌殘留造成二次污染；
④ 由于胚胎干細(xì)胞（H1、H9、iPS）非?！按嗳酢?，若污染嚴(yán)重，建議采用2000×濃度清除細(xì)菌。
3.預(yù)防細(xì)菌污染操作規(guī)程
若細(xì)胞需連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)存在共用實(shí)驗(yàn)儀器、耗材、試劑或?qū)嶒?yàn)室曾經(jīng)出現(xiàn)過大規(guī)模的細(xì)菌污染，建議每2~3周進(jìn)行定期預(yù)防。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量細(xì)菌清除劑，通常推薦使用的稀釋倍數(shù)為3000×，如：6mL的細(xì)胞培養(yǎng)基加入2μL的細(xì)菌清除劑混勻。連續(xù)加藥培養(yǎng)1周后即可有效防止細(xì)菌污染或抑制細(xì)菌增殖。
4.實(shí)驗(yàn)流程圖
5. 特別提醒
① 為了發(fā)揮最好的藥效，含藥培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，如果加藥培養(yǎng)基未用完，于4℃冰箱中避光保存，2周內(nèi)用完，使用培養(yǎng)基前需預(yù)熱至37℃；
② 如遇個(gè)別細(xì)胞對本試劑敏感，細(xì)胞生長速度明顯受影響時(shí)，建議減量使用或進(jìn)行稀釋度測試；
③ 細(xì)菌清除劑處理后，會有很好的預(yù)防和清除效果，但是如果環(huán)境、耗材、試劑中仍有污染源存在，細(xì)胞可能會再次污染，因此需做好適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施；
6.清除案例
