入門(mén)必看 | 深度解析長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR-RTs）
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0.5422020.11.12 16:51:57字?jǐn)?shù) 3,036閱讀 990
提起 LTR，相信很多人和我之前一樣都是熟悉又陌生的感覺(jué)，聽(tīng)過(guò)或者接觸過(guò)卻未深入了解過(guò)。若您對(duì) LTR 分析有興趣，卻苦于無(wú)從下手時(shí)，愿本文作為一個(gè)叩門(mén)磚，為您敲開(kāi) LTR 分析的大門(mén)。本篇從 LTR 的定義、分類(lèi)、生物學(xué)意義、結(jié)構(gòu)特征、鑒定方法等方面層層遞進(jìn)，帶您走進(jìn)神奇的 LTR 世界。
1. LTR 與重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子的關(guān)系
LTR-RTs 是 Long terminal repeat-retrotransposons 的縮寫(xiě)，中文名是長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)座子。LTR-RTs 名字中既有重復(fù)、又有轉(zhuǎn)座子，那么它和重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子是什么關(guān)系呢？圖1 為您解答。
圖1??重復(fù)序列主要分類(lèi)
重復(fù)序列：根據(jù)重復(fù)區(qū)域是否連續(xù)可分為串聯(lián)重復(fù)序列和散在重復(fù)序列（又名轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座元件）兩大類(lèi)，前者相連，后者不相連。
轉(zhuǎn)座元件(transposable elements, TEs) 又稱(chēng)轉(zhuǎn)座子：指在基因組中能夠移動(dòng)或復(fù)制，并可以整合到基因組新位點(diǎn)的一段 DNA 序列。根據(jù)轉(zhuǎn)座過(guò)程是否形成 RNA 中間體，轉(zhuǎn)座子可分為 DNA 轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是以 RNA 為媒介，伴有反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，以復(fù)制-粘貼的方式在基因組的新位置產(chǎn)生一個(gè)新的拷貝。DNA 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制則是剪切-粘貼的形式。
LTR-RTs :是反轉(zhuǎn)座子中的一種，因其兩側(cè)存在長(zhǎng)的末端重復(fù)而得名。不含長(zhǎng)末端重復(fù)的反轉(zhuǎn)座子統(tǒng)稱(chēng) non-LTR-RTs，主要包含短散在重復(fù)(SINE)和長(zhǎng)散在重復(fù)(LINE)。
2. LTR的分類(lèi)
動(dòng)植物基因組中存在大量轉(zhuǎn)座子，尤其是植物基因組中。LTR ?因其數(shù)量多且 LTR 長(zhǎng)度巨大，在植物轉(zhuǎn)座子中具有較高的基因組含量。在玉米基因組中 LTR 占基因組含量高達(dá) 75% ，山蒼子基因組中 LTR 占比高達(dá) 47%，所以基因組 LTR 的鑒定尤為重要。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子根據(jù)轉(zhuǎn)座元件結(jié)構(gòu)的完整性和轉(zhuǎn)座特點(diǎn)可分為自主元件（編碼轉(zhuǎn)座酶）和非自主元件（自身不編碼轉(zhuǎn)座酶）。非自主轉(zhuǎn)座元件需在自主元件的協(xié)助下才能發(fā)生轉(zhuǎn)座。完整的 LTR-RTs 由兩端序列完全一致的末端重復(fù)、GAG（衣殼蛋白）和 POL 構(gòu)成，后生動(dòng)物中含 ENV （包膜蛋白）。其中 POL 包含 AP（天冬氨酸酶）、INT（整合酶）、 RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）和 RH（核糖核酸酶 H），是 LTR 能否自主轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵蛋白。LTR 分類(lèi)見(jiàn)圖 2，在高等植物中主要主要包括 Ty1/Copia和 Ty3/Gypsy 兩個(gè)超家族，二者差別在于 INT 的位置不同。
圖2??LTR?的分類(lèi)[1]? ??? ? P: 植物? M: 后生動(dòng)物? F :真菌? O：其他
3. LTR的生物學(xué)意義
不少研究表明活性 LTR 插入到關(guān)鍵基因內(nèi)或周邊會(huì)導(dǎo)致性狀改變。2019 年，發(fā)表在 Nature Communications 的《A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour》文章中揭示蘋(píng)果紅皮表型形成與一個(gè) LTR-RT 插入相關(guān)。MdMYB1 有 MdMYB11-1、MdMYB1-2 和 MdMYB1-3 三個(gè)等位基因，其中 MdMYB1-1 是控制蘋(píng)果果皮花青素合成的單一顯性基因。相較于黃蘋(píng)果基因組，在紅蘋(píng)果基因組的 MdMYB1-1 基因啟動(dòng)子上游有一個(gè) LTR-RT（命名為 redTE）插入，并經(jīng)過(guò) PCR 驗(yàn)證是紅蘋(píng)果中存在一段特異的序列（圖 3）。redTE 作為一種增強(qiáng)子，增強(qiáng) MdMYB1-1 對(duì)光的敏感性，從而累計(jì)花青素，形成紅色表皮。
圖3? 蘋(píng)果紅皮 LTR-RT 插入[2]??
此外，LTR?的擴(kuò)張和收縮也影響著基因組大小，上期小葉茶文獻(xiàn)《Mol Plant 項(xiàng)目文章 | 第一個(gè)茶樹(shù)染色體級(jí)別高質(zhì)量參考基因組發(fā)布》中，揭示小葉茶基因組中 LTR 的擴(kuò)張尤其是非自主 LTR 的擴(kuò)張是小葉茶基因組龐大的主要原因。
4. LTR-RTs 的結(jié)構(gòu)特征
典型的 LTR-RTs 的結(jié)構(gòu)有 5 個(gè)特征，其模式圖見(jiàn) 4-1，各特征意義如下：
圖 4-1? 典型 LTR 的結(jié)構(gòu)特征[3]
(1) TSR（TSD）: 目標(biāo)重復(fù)位點(diǎn)，是 4~6bp 的短的重復(fù)序列，在 5’LTR and 3’LTR 兩側(cè)，是轉(zhuǎn)座子插入的信號(hào)。
(2) 5’LTR and 3’LTR : ?LTR 兩端序列完全一致的末端重復(fù)， TG..CA box，完整的 LTR 均含有此結(jié)構(gòu)。LTR 長(zhǎng)度一般在 85~5000bp。
(3) PBS(primer binding site) 引物結(jié)合位點(diǎn): 在 5’LTR 的末端，可與一些 tRNA 3’ 末端互補(bǔ)結(jié)合的一段 18bp 左右的序列，是反轉(zhuǎn)錄的第一步。
(4)?蛋白區(qū)域: 長(zhǎng)度通常在 1000~15000bp。
GAG：衣殼蛋白。
POL：包含4中酶，由AP（天冬氨酸酶）、IN（INT,整合酶）、RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）、RH（核糖核酸酶），LTR 能否自主轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵原因。
ENV：包膜蛋白，后生動(dòng)物中存在。
(5) PPT：3’LTR 的起始位置短的富含嘌呤的序列，11~15bp。
LTR 在生物體內(nèi)歷經(jīng)成千上萬(wàn)年的進(jìn)化，發(fā)展出許多存在形式（圖 4-2）。我們通常將包含兩個(gè)相對(duì)完整的 LTRs 和已識(shí)別的 PPT 和 PBS 位點(diǎn)的元素，且兩側(cè)有 TSD 的 LTR 定義為 Intact LTR（A）。由于 LTR-RTs 兩端序列非常相似，LTR-RTs 內(nèi)可發(fā)生重組，導(dǎo)致內(nèi)部元件消失，形成 solo LTR（C），而 solo LTR 的數(shù)量表明了一個(gè)基因組中 LTR 去除的頻率和效率。此外 LTR 發(fā)生缺失、易位可形成截?cái)嗟?LTR（B）。LTR 也會(huì)經(jīng)常插入到其他 LTR 內(nèi)部區(qū)域，形成嵌套 LTR（D）。因存在這些突變機(jī)制，實(shí)際上完整的 LTR-RTs （A）只占基因組中所有 LTR-RT 相關(guān)序列的一小部分。
圖 4-2? LTR 存在形式[4]
5. LTR-RTs 鑒定方法
LTR-RT 的鑒定方法基本歸于三類(lèi)：從頭預(yù)測(cè)、基于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、基于同源比對(duì)。LTR_STRUC[5]?是一款最早的從頭預(yù)測(cè) LTR 的軟件，LTR_finder[3]?和 LTRharvest[6]?是目前為止鑒定 LTR 最敏感的程序，但假陽(yáng)性依然很高。RepeatMasker[7]?基于數(shù)據(jù)庫(kù)，使用同源方法來(lái)預(yù)測(cè) LTR，但不同物種 LTR 差異較大，構(gòu)建物種特有的 LTR 庫(kù)非常必要。在 2017 年密歇根州立大學(xué)園藝系的 Shujun Ou 團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā) LTR_retriever[4]?平臺(tái)用于 LTR 的鑒定，文章發(fā)表在 Plant Physiology 上。這是一款整合軟件，以一個(gè)或多個(gè) LTR 預(yù)測(cè)軟件鑒定 LTR 的結(jié)果作為輸入文件，通過(guò)不同模塊（圖 5-1）對(duì) LTR 進(jìn)行過(guò)濾和修正來(lái)對(duì)預(yù)測(cè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合和調(diào)整，以得到非冗余精準(zhǔn)且完整的物種特異 LTR 庫(kù)，再使用 RepeatMasker[7]?進(jìn)行預(yù)測(cè)
圖 5-1??LTR_retriever 整合模塊[4]
LTR_retriever 軟件從 sensitivity（敏感性）、specificity（特異性）、accuracy（準(zhǔn)確性）、precision（精確度）四個(gè)維度對(duì) LTR 鑒定結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，其具體意義見(jiàn)圖 5-2。以真實(shí) LTR 和非 LTR 序列作為參考庫(kù)，使用軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果分為以下四類(lèi)：
TP：真陽(yáng)性，真實(shí)的 LTR，被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出
FN：假陰性 ，真實(shí)的 LTR，未被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出
TN：真陰性 ，非 LTR 序列未被預(yù)測(cè)當(dāng)成 LTR
FP：假陰性，非 LTR 序列被當(dāng)成 LTR
從下圖公式可知敏感性代表對(duì)真正 LTR 的檢出能力，特異性代表排除非 LTR 序列的能力，精確性代表正確檢出的能力，精確度代表檢出結(jié)果的真陽(yáng)性率，精確度越高則表明結(jié)果越可靠。
圖 5-2? 鑒定結(jié)果評(píng)估指標(biāo)[8]
使用 LTR_retriever 對(duì)現(xiàn)有軟件預(yù)測(cè) LTR 結(jié)果進(jìn)行，評(píng)估結(jié)果（圖 5-3）顯示 LTR_retriever 明顯優(yōu)于其他現(xiàn)有軟件，而 Shujun Ou 團(tuán)隊(duì)在 2019 發(fā)表在 Genome Biology 上的有關(guān)轉(zhuǎn)座子注釋方法中推薦 LTR 的鑒定方法是使用以 LTR_finder 和 LTRharvest 軟件鑒定結(jié)果作為 LTR_retriever 的輸入文件[8]。
圖 5-3? 不同 LTR 鑒定方法比較[4]??
6. 諾禾致源為您定制專(zhuān)屬 LTR 分析方案
隨著三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，借助于超長(zhǎng)度長(zhǎng)序列，重復(fù)序列的組裝將會(huì)越來(lái)越精確。人們對(duì)重復(fù)序列的研究會(huì)更加深入，而 LTR 因其特殊的生物學(xué)意義被格外關(guān)注。LTR 的鑒定是 LTR 相關(guān)分析的基礎(chǔ)，目前 LTR 分析方法尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)。表 6-1 是諾禾致源公司聯(lián)合發(fā)表的 LTR 分析相關(guān)文章列表。諾禾致源 LTR 分析流程中，先使用 LTR_finder 和 LTRharvest 對(duì) LTR 進(jìn)行鑒定，再利用 LTR_retriever 進(jìn)行整合，構(gòu)建非冗余精準(zhǔn)的物種特異 LTR 數(shù)據(jù)庫(kù)后使用同源預(yù)測(cè)方法進(jìn)行注釋?zhuān)龠^(guò)濾掉假陽(yáng)性，為您注釋出全面且精確的物種 LTR 序列，包括 intact LTR、solo LTR、LTR 相關(guān)序列，非典型 LTR 等。明確 LTR 含量在基因組中的占比，在染色體上的分布情況（圖 6-1）。
圖?6-1? LTR?在染色上分布[9]
根據(jù)物種 LTR 蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì) LTR-RT 進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋和家族鑒定。LTR 分析很多，可根據(jù)物種 LTR 鑒定結(jié)果、生物學(xué)意義進(jìn)行特殊分析，例如通過(guò)聚類(lèi)分析，確定基因組中主要的 LTR 屬于何種家族（圖 6-2）；對(duì) LTR 進(jìn)行插入時(shí)間評(píng)估分析，探索 LTR 的進(jìn)化動(dòng)態(tài)（圖 6-3）；構(gòu)建特殊家族進(jìn)化樹(shù)，研究某類(lèi) LTR 的進(jìn)化等。此外，轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的表觀遺傳變化經(jīng)常影響相鄰基因的差異表達(dá)并產(chǎn)生新的調(diào)控模式，例如前面所提的蘋(píng)果表皮顏色性狀文獻(xiàn)中檢測(cè)到紅蘋(píng)果 redTE 序列中有幾個(gè)區(qū)域明顯高度甲基化，這為 LTR 分析提供新的思路。
圖?6-2??LTR?家族鑒定[10]
圖?6-3??LTR?插入時(shí)間分析[11]
表 6-1? 諾禾合作發(fā)表有關(guān) LTR 分析高分合作文章?
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