Part 4 DFI strengthens vaccine responses

Para1:
隨著年齡的增加，T細(xì)胞介導(dǎo)的疫苗應(yīng)答效應(yīng)減弱。本研究選取成年（6周齡）和老年（72周齡）小鼠，以卵清蛋白作為模型抗原進(jìn)行疫苗接種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，① 與成年組相比，老年組小鼠在接種疫苗后，脾臟和血液中產(chǎn)生的卵清蛋白特異性CD8+ T細(xì)胞數(shù)量非但沒有增加，反而顯著減少，與既往報道一致；② 當(dāng)這些小鼠再次接觸相同抗原時，其T細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-2和IFNγ水平也明顯降低。總體而言，老年小鼠的這些免疫應(yīng)答指標(biāo)嚴(yán)重受損，其反應(yīng)強(qiáng)度幾乎與未接種疫苗的對照組老年小鼠處于同一水平，即是否接種疫苗對老年組無效 (Supplementary Fig. 3A–D)。但如果對老年小鼠進(jìn)行疫苗接種前注射DFI，可增加老年小鼠脾臟和血液中總T細(xì)胞及CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量(Fig. 3a–d)?；诖?，本研究進(jìn)一步探究DFI是否能逆轉(zhuǎn)老年小鼠對疫苗的低應(yīng)答狀態(tài)。

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• Fig 3a: 實(shí)驗(yàn)設(shè)計示意圖。老年小鼠每周兩次接受DFI或?qū)φ眨↙uc）mRNA-LNPs處理，持續(xù)28天，隨后使用佐劑化OVA進(jìn)行免疫
• Fig 3b: 小鼠脾臟中總T細(xì)胞數(shù)量，組間比較分析
• Fig 3c-d: 脾臟中SIINFEKL–H-2K?四聚體陽性CD8? T細(xì)胞的頻率及數(shù)量，組間比較分析
• Supplementary Fig 3A: 流式分選小鼠脾臟及外周血中SIINFEKL-H-2K?四聚體結(jié)合CD8? T細(xì)胞（SIINFEKL：是一個來自卵清蛋白的特定肽段，作為模型抗原；H-2K?：是小鼠MHC I類分子，負(fù)責(zé)將肽段呈遞給CD8? T細(xì)胞→精確量化識別卵清蛋白的殺傷性T細(xì)胞，以此評估抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的效能）
• Supplementary Fig 3B: 小鼠皮下接種卵清蛋白肽疫苗的實(shí)驗(yàn)時間線，隨后進(jìn)行體外脾細(xì)胞SIINFEKL肽再刺激及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色
• Supplementary Fig 3C: 外周血及脾臟中SIINFEKL-H-2K?四聚體結(jié)合T細(xì)胞的頻率，以及體外SIINFEKL再刺激24小時后總T細(xì)胞計數(shù)相對于對照組的倍數(shù)變化。
• Supplementary Fig 3D: 體外SIINFEKL再刺激6小時后，脾細(xì)胞中IL-2與IFN-γ表達(dá)水平相對于對照組的倍數(shù)變化

Para2:
疫苗在老年小鼠中失效主要源于兩方面：新生免疫細(xì)胞減少，以及現(xiàn)存細(xì)胞逐步轉(zhuǎn)向功能失調(diào)狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，① 衰老小鼠體內(nèi)確實(shí)會積累PD1高表達(dá)、CD62L陰性的T細(xì)胞 (Fig. 2a and Extended Data Fig. 1e,i)，且反復(fù)接種疫苗會進(jìn)一步加劇該耗竭樣表型的擴(kuò)增，而成年小鼠無此現(xiàn)象(Fig. 3f)；② 經(jīng)DFI預(yù)處理后接種疫苗，na?ve T細(xì)胞比例得以維持，PD1高表達(dá)CD62L陰性T細(xì)胞數(shù)量減少(Fig. 3e–g)，表明免疫細(xì)胞組成趨向健康；③ 功能上，DFI處理小鼠的CD8****? T細(xì)胞在抗原再刺激時能產(chǎn)生更高水平的IL-2和IFNγ，而CD4****? T細(xì)胞的抗原特異性頻率及相關(guān)細(xì)胞因子變化不顯著(Fig. 3h and Supplementary Fig. 4a–e)。以上結(jié)果說明，DFI能優(yōu)先支持并增強(qiáng)CD8****? T細(xì)胞介導(dǎo)的疫苗免疫應(yīng)答。

Tip: PD1高表達(dá)、CD62L陰性的T細(xì)胞是什么？
PD1high 表明這些細(xì)胞處于長期、慢性抗原刺激下，其增殖和效應(yīng)功能已受到抑制；CD62L是介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢至淋巴結(jié)的關(guān)鍵分子，其陰性表明該細(xì)胞已離開淋巴器官，進(jìn)入外周炎癥組織或血液循環(huán)。這兩個組合代表了一群 “長期被抗原刺激、已遷移至外周、但功能逐漸衰竭的T細(xì)胞”。它們的擴(kuò)增擠占了健康初始和記憶T細(xì)胞的空間，是導(dǎo)致疫苗應(yīng)答無效的重要原因。

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• Fig 3e: 脾臟中 naive T cells（CD44?CD62L?）的頻率，組間比較
• Fig 3f: 脾臟中耗竭表型T細(xì)胞（CD62L?PD1high）的頻率，組間比較
• Fig 3g: 重復(fù)OVA或假性（載體）疫苗接種后 naive T cells 與耗竭T細(xì)胞的比例及其比值
• Fig 3h: 功能性抗原回憶反應(yīng)：經(jīng)6小時 SIINFEKL 再刺激后，胞內(nèi)因子IL-2（左）與 IFNγ（右）熒光強(qiáng)度變化。
• Supplementary Fig. 4A：實(shí)驗(yàn)流程圖：為期28天的DFI或?qū)φ誱RNA-LNP處理，隨后進(jìn)行佐劑化OVA蛋白皮下免疫實(shí)驗(yàn)，初次免疫后35天進(jìn)行免疫應(yīng)答分析
• Supplementary Fig. 4B：針對免疫優(yōu)勢OVA肽段OVA323-339特異的I-A?四聚體結(jié)合CD4? T細(xì)胞的頻率，組間比較
• Supplementary Fig. 4C-E：經(jīng)體外OVA再刺激后，IFN-γ?、T-bet?及IL-17? CD4? T細(xì)胞的頻率，組間比較

Para3:
本研究進(jìn)一步延長了實(shí)驗(yàn)周期，在一項(xiàng)覆蓋小鼠全生命周期的疫苗接種研究中，DFI治療能使老年小鼠疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞數(shù)量顯著提升，達(dá)到與年輕得多的小鼠相近的水平，免疫應(yīng)答能力恢復(fù)可恢復(fù)至約小鼠24-week的狀態(tài) (Fig. 3i)。

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• Fig 3i: 測量了不同年齡下SIINFEKL–H-2K(b)四聚體陽性T細(xì)胞的頻率，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合。基于此擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步推算出經(jīng)DFI或Luc mRNA-LNPs預(yù)處理的52周齡老年小鼠所對應(yīng)的“免疫接種應(yīng)答年齡”。

Para4:
綜合以上結(jié)果，完整的DFI聯(lián)合方案可有效逆轉(zhuǎn)衰老相關(guān)的CD8+ T細(xì)胞疫苗應(yīng)答缺陷。這一發(fā)現(xiàn)也印證了一個更廣泛的免疫學(xué)原理：即使在衰老狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)在獲得充分且適宜的刺激后，仍具備激發(fā)有效免疫應(yīng)答的潛能。