一、梗死心臟中巨噬細胞的時空動力學和Trem2hi巨噬細胞的潛在功能
前幾天Online的一篇NC，做的是心梗的單細胞+空轉(zhuǎn)。
看完感覺這篇文章和同期online的做心梗單細胞+空轉(zhuǎn)的這篇nature人類MI的空間多組學圖譜之間的差距，得有100篇NC吧...（這篇實屬單細胞套路文章）
1. Immune cell dynamics after MI
Fig 1a：對正常、心梗d1、d3、d5、d7的心臟進行了了流式分選，得到cd45+的免疫細胞，進行了單細胞測序 (每組一個樣品)。
Fig 1b, c：一共得到33977個細胞，注釋得到12個細胞群。
Fig 1d：細胞比例結果顯示正常心臟中巨噬細胞最多，MI后1天中性粒細胞出現(xiàn)明顯增多，隨后又逐漸減少。巨噬細胞在1天時減少，隨后逐漸增多。
對比下面兩篇，這一篇送的時間點只有Inflammatory phase和Proliferative phase
2. Spatiotemporal profiles of immune cells after MI
Fig 2a：作者對心梗d1、d3、d5、d7的心臟進行了空間轉(zhuǎn)錄組測序。
Fig 2b, c：聚類得到5個cluster。梗死灶的中性粒細胞在d1時最多，隨后逐漸減少，而巨噬細胞則持續(xù)增多。
3. The heterogeneity of monocytes and macrophages and their temporal dynamics after MI
這部分對單核細胞的單細胞數(shù)據(jù)進行了重新聚類，得到16個cluster，查看了一下marker基因和比例變化。
將細胞主要分為了如下幾類：
steady-state macrophage (
SS-Mφ): 1, 3, 13
Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ: 4,10,14
Transient-Mφ：7, 8, 12
Late-Mφ: 2,5
IFN-Mφ: 6, 15
proliferating macrophages: 9, 11
non-classical monocytes: 16
4. Single-cell trajectories in the infarcted heart
對所有的單核巨噬細胞做了擬時序分析，找到一些擬時相關基因。Early-Mφ 特異性基因如Ccr2, Chil3, 和 Clec4e的表達，在Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中上調(diào)，隨后在Transient-Mφ重下調(diào)，在Late-Mφ 中處于一個較低水平。與之相反，Late-Mφ-特異性基因比如 Trem2, Rgs10 和 Fcrls，在 Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中下調(diào)，然后在Transient-Mφ 和 Late-Mφ 中逐漸上升。
免疫組化查看了這些基因的定位，Trem2主要在梗死灶。
5. Neutrophil and DC subpopulations
對粒細胞和DC做了亞群細分，描述了一下比例變化。（跟主線毫無關系，完全可以放在附圖里）
6. The expression of Trem2 after MI
后面作者就直接關注了Trem2（是個比較火的靶點）
Trem2 is highly expressed by macrophages in the infarcted heart and sTrem2 is exclusively secreted from Trem2hi macrophages.
7. Trem2hi macrophages accumulating in injured hearts late after MI are anti-inflammatory
Trem2hi macrophages are dominant in the late phase of MI and possess anti- inflammatory characteristics.
8. Improvement of left ventricular remodeling after in vivo injection of soluble Trem2
給小鼠注射sTrem2可以改善心梗小鼠心臟功能
整個文章做的非常常規(guī)，也沒有用什么有意思的分析方法。但是Trem2這個靶點還是值得關注的。
近年來，越來越多的研究表明髓系來源的細胞在各種病理學中的核心作用。其中髓系細胞觸發(fā)受體2 （triggering receptor expressed on myeloid cells-2 TREM2）被認為是病理性誘導的免疫信號樞紐。TREM2是多種配體的受體，這些配體大多是組織損傷的標志。在生理狀態(tài)下中，TREM2的活性僅限在特定的組織中，而在病理狀態(tài)中，TREM2信號途徑成為感知組織損傷并抑制損傷的免疫信號樞紐。這些發(fā)現(xiàn)也激發(fā)了學術界和工業(yè)界的熱情，以探索調(diào)控TREM2活性的策略，并用于治療疾病的可能性。
Cell. 2020 Jun 11;181(6):1207-1217.
二、MI的動態(tài)間質(zhì)細胞反應預測不同基因背景小鼠的心臟破裂風險
這一篇是2020年發(fā)在cell reports上的文章
1. Single-Cell Analysis Defines the Interstitial Cell Landscape Post-MI
Since the epicardium, the mesothelium covering the heart, is the major source (～80%) of cardiac fibroblasts in homeostasis，作者使用了C57BL/6J Wt1Cre;RosaZsGreenf/+小鼠。這種示蹤鼠的epicardial derivatives細胞(也就是心臟間質(zhì)細胞)都是綠色。
作者分選了con和心梗d1, 3, 5, 7, 14, 28的小鼠心臟中活的有核細胞進行了單細胞測序。(炎癥期：d1, 3；增殖期：d5, d7；成熟期：d14, d28)
一共得到了36,847細胞，注釋得到16個主要的細胞群。其中ZsGreen+的細胞包括epicardium, SMC和FB I-III (5群，見E圖)。
細胞比例變化結果顯示心梗早期固有免疫細胞出現(xiàn)顯著聚集，1d時中性粒細胞達到peak。單核巨噬細胞在7天達到peak。成熟期主要以成纖維和內(nèi)皮為主。適應性免疫細胞和血管/壁細胞比較穩(wěn)定。
Wt1在成年小鼠心臟的外膜表達，也在內(nèi)臟器官的間皮中表達，可用作譜系追蹤和標記Wt1表達細胞，常用于研究心臟、精子的發(fā)育及肝損傷等。
2. Dynamics of Stromal Populations Involved in Scar Formation
為了進一步探究stromal transition，作者將ZsGreen+的五群細胞提出來做了亞群細分，得到12群。其中3群(DC, IFN response, Epicardium)因為混雜了其他細胞，沒有納入后續(xù)分析。剩余的9群細胞，作者使用SPRING做了軌跡分析，并展示了9群的特異性通路。
??成纖維亞群注釋可以參考c圖
epicardial-derived fibroblasts (EpiDs): Dpep1, Lpl, Hsd11b1, Cxcl14
homeostatic epicardial derived fibroblasts (HEpiDs):
progenitor-like state fibroblasts (PLSs): Cd248, Pi16, Ly6a
late-resolution (LR) fibroblasts: Adamtls2, Cilp, Col8a1, Meox1
injury response (IR) fibroblasts: Mt1-2
endocardial-derived fibroblasts (EndD): Wif1, Dkk3
Fig 2d中看到EndD自己出現(xiàn)了一個分支，作者在homeostatic ventricles中做了一下驗證。結果顯示marker基因DKK3在穩(wěn)態(tài)下就存在于冠脈血管周和瓣膜成纖維細胞周，提示EndD從內(nèi)皮轉(zhuǎn)分化成成纖維的亞群是胚胎起源的，不是疾病激活的。
前面驗證了EndD群，這里驗證了一下injury response (IR) fibroblasts群。這群細胞高表達Mt1-2，而且分泌多種細胞因子，參與多種信號通路。隨后作者使用免疫熒光驗證了Mt1-2在基質(zhì)細胞中的表達。
隨后，作者探究了Myofb, MFCs 和 LR在MI后的心室重塑中的作用。
Figure 2D中的結果顯示 EpiD ZsGreen+ 細胞和 Myofb 細胞存在一個線性分化關系。有3群Myofb被鑒定出來，包括主要存在于d3-d7的Myofb (Acta2, Cthrc1), ProlifMyofb (Acta2, Cthrc1, cell-cycle genes)和一群最近鑒定出來的主要存在于d14-d28成熟scar中的 matrifibrocytes。
Compared to Myofb, MFCs had reduced expression of genes associated with contractility (Acta2, Tagln, Tpm2, and Myl9) or ECM components (Timp1, Tnc, Cthrc1, and Col1a1), but expressed Comp and Angptl7 and Fbln1 and Cilp, supporting the transition to a less contractile, less secretory cell type producing components of a more stable, chondrogenic-like ECM.
為了可視化這些細胞間的關系，作者使用ACTA2和CTHRC1作為 Myofb的markers，使用SFRP2和CLU作為 MFC的markers，進行了免疫熒光染色。Myofb主要在5-7天比較多，MFC則主要在d14-d28比較多。qPCR也驗證了上面的結果。
3. Genetically Determined Factors Confer Resilience to Cardiac Rupture
不同品系的小鼠在相同處理下心臟的反應性不同。作者探究了9種對MI具有不同反應性的小鼠C57BL/6J or B6J (control), 129S1/SvlmJ or 129 (prone to hypertension), DBA/2J (prone to calcification), NOD/ShiLtJ (prone to type 1 diabetes), NZO/HlLtJ (obese), A/J (prone to muscular dystrophy), and three wild-derived strains (CAST/EiJ, WSB/EiJ, and PWK/PhJ)對MI的反應性。其中129的rupture率(59%)最高，B6J小鼠只有(13%)。
為了探究rupture的機制，作者取了MI d3 (pre-rupture)的B6J和129小鼠的心臟間質(zhì)細胞，進行了單細胞測序。兩組間的細胞比例顯示Post-MI 129 心臟的 Myofb, ProlifMyofb 和 IR fibroblasts 比 B6J 要多。
和c57相比，d3的129 MI小鼠間質(zhì)細胞出現(xiàn)了3922個差異表達基因，a圖展示了差異分析富集到的通路。b-d圖展示了血管生成反應、ECM沉積、急性期反應和凝血三條通路中的關鍵基因的表達。這些基因在129 MI小鼠間質(zhì)細胞顯著升高。
In summary, the increased susceptibility of 129 hearts to rupture is associated with persistent coagulation and impaired fibrinolysis that increases instability in the injury site, which is also supported by the higher responsiveness to angiotensin.
三、單細胞測序揭示心梗后內(nèi)皮細胞可塑性和瞬時間質(zhì)活化
這一篇是21年的一篇NC，對心梗不同點的小鼠心臟的非心肌(包括內(nèi)皮和成纖維)進行了單細胞測序，主要關注了內(nèi)皮細胞。
1. Kinetics of EC inflammation, survival, and proliferation.
作者對con和MI后d1, 3, 5, 7, 14和28的小鼠非心肌細胞進行了單細胞測序。（和上面那篇的分組一模一樣哦），得到19群細胞 (4群內(nèi)皮，5群單核巨噬，1群T，1群B，6群成纖維)。在MI 1w內(nèi)，內(nèi)皮和間質(zhì)細胞比例下降，免疫細胞增多。隨后作者對不同時間點的EC做了通路富集，發(fā)現(xiàn)早期缺氧通路活化，相關基因Hif1a, Ldha以及炎癥因子Il1b, Il6 和 Tnf在早期出現(xiàn)上調(diào)。而在d1-d7，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路被富集到。細胞周期分析也顯示d3時候分裂期細胞增加，分裂期相關基因表達也增加。
2. ECs acquire a transient state of mesenchymal transition after MI.
隨后對EC細胞做了擬時序分析，得到5個state。
可以看到MI后d1和control相比，state 2出現(xiàn)了明顯增加。這一群的特異性基因和通路富集提示它與中性粒細胞脫顆粒和炎癥反應有關。在MI后1-7天的時間里，state 4出現(xiàn)明顯增加，隨后又下降。這一群細胞主要富集到extracellular matrix，脂肪酸攝取信號通路則出現(xiàn)下調(diào)。state 4的特異性基因包括間質(zhì)基因，細胞周期基因和增殖基因如Col3a1, Fn1, Serpine1。
state 4的間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關基因在早期出現(xiàn)上調(diào)(d)，分選了con和AMI d3的cdh5細胞進行bulk RNA測序也得到了一致的結論(e)。
當對所有的EC(clusters 6, 7, 17, and 18)進行分析的時候也發(fā)現(xiàn)了存在EC基因表達下降和間質(zhì)基因表達上升(f, g)。
This suggests that EC acquire a transient mesenchymal activation (EndMA) state in the first week after MI.
隨后作者對EC進行了亞群細分，得到了間質(zhì)內(nèi)皮(4-6)和幼稚內(nèi)皮。間質(zhì)內(nèi)皮和幼稚內(nèi)皮都出現(xiàn)了早期MI后內(nèi)皮基因表達的丟失 (c) 和間質(zhì)基因表達的上升 (d) 。間質(zhì)內(nèi)皮細胞在d1-d7比例上升，state 4的細胞也主要是間質(zhì)內(nèi)皮細胞。
隨后作者通過免疫熒光檢測了心臟梗死后D3的內(nèi)皮間質(zhì)基因表達，發(fā)現(xiàn)表達增加。
isolectin B4染色評估新生血管情況
MI不同時間點心臟，示蹤鼠(內(nèi)皮綠色)和間質(zhì)marker Pdgfra共染，也提示早期間質(zhì)內(nèi)皮的增加。
為了證實間質(zhì)細胞可以revert to 內(nèi)皮細胞表型，作者使用了Col1a2-CreERT2;mT/mG 鼠進行了collagen-tracing 研究 。小鼠在誘導MI后d3, 4, 5, 6,7 給了tamoxifen，28天的時候送了單細胞測序。結果顯示EC中存在GFP+細胞。提示Col1a2 traced cells can become transcriptionally similar to endothelial cells between day 7 and day 28 after infarction. 熒光結果也提示GFP陽性細胞和內(nèi)皮marker Isolectin B4存在共表達。
3. Characterization of EndMA cells.
為了進一步理解EndMA的特性，作者將表達間質(zhì)marker的EndMA+和不表達間質(zhì)marker的EndMA-細胞做了差異分析和功能富集。結果顯示EndMA細胞高表達間質(zhì)和細胞外基質(zhì)基因。上調(diào)的通路包括extracellular matrix organization, Pdgf binding, collagen synthesis, and organization等。
此外兩組細胞間還出現(xiàn)了明顯的代謝差異。EndMA細胞高表達糖酵解相關基因，EndMA-細胞則高表達三羧酸循環(huán)和脂肪酸代謝相關基因。
對不同時間點的內(nèi)皮進行分析也提示MI后d1的內(nèi)皮細胞出現(xiàn)明顯糖酵解基因的高表達，d3則轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)相關基因，documented an adaptation of EC metabolism during the time frame in which mesenchymal activation occurs.
4. Cdh5-lineage tracing confirms the transient nature of EndMA after MI
前面的數(shù)據(jù)表明，MI 在與 EndMA 相關的內(nèi)皮細胞中誘導了短暫的代謝和表型轉(zhuǎn)換。 然而，在沒有譜系示蹤的情況下，我們可能錯過了完全轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型并失去 EC 標記基因表達的 EC。 為了表征 EC 的長期命運，作者使用了endothelial fate-mapped mT/mG reporter mice (Cdh5- CreERT2;mT/mG)，并對不同MI時間點的小鼠心臟非心肌進行了單細胞測序，結果顯示他莫昔芬注射導致預期的 GFP 在內(nèi)皮細胞中的誘導(a-c)。
為了探究EndMA的動力學，作者評估了不同時間點間質(zhì)marker在GFP+細胞中的表達。和預期的一致，GFP+Cdh5+的內(nèi)皮細胞在d3, d7的時候，間質(zhì)marker Col1a1, Col3a1和Serpine1表達出現(xiàn)明顯增加。但是有趣的是，在晚期d14, d28并沒有觀測到明顯的完全轉(zhuǎn)化的(不表達內(nèi)皮marker的) mesenchymal GFP+ 細胞的增加 (d)。
作者對GFP+細胞的重新聚類鑒定出了一群EndMA (cluster 6)，這群細胞高表達膠原但是低表達內(nèi)皮marker。這群細胞也是在d7比例更高，consistent with a transient mesenchymal transition of ECs after MI。
5. Mesenchymal transition is reversible in vitro.
前面的研究結果提示心梗后，內(nèi)皮細胞 transiently 獲得 reversible partial mesenchymal state。所以作者在體外驗證了這個結論。
作者在體外將EC和TGF-β2共孵育了3天，然后撤回刺激。3天的TGF-β2孵育誘導EC表達了間質(zhì)marker calponin (CNN1) 和 SM22 (TAGLN)，孵育3天后撤銷TGF-β2的內(nèi)皮在d7時的間質(zhì)marker表達恢復到正常水平，而在1-7d持續(xù)孵育TGF-β2的內(nèi)皮則在d7時間質(zhì)marker的表達進一步升高。（使用TGF-β1, IL-1β和L-NAME的組合來誘導內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也得到了一致的效應）
為了探究TGF-β2的干預是否引起了true fate change，作者分析了間質(zhì)基因的DNA甲基化情況。結果并沒有觀察到間質(zhì)基因COL4A1, TAGLN和CNN1在給予TGF-β2干預和撤退后出現(xiàn)了DNA甲基化，However, we observed a reversible demethylation of regulatory regions upon TGF-à2 stimulation (Supplementary Fig. 17d)。
These observations confirm that mesenchymal gene expression induced by several different protocols is reversible and is associated with changes in DNA methylation of regulatory regions.
