作者：hony
審稿：童蒙
編輯：angelica

引言

轉(zhuǎn)眼間，從事生信工作已數(shù)年有余。在這期間，一直專注于基因組方面。項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)較多，涉及的物種也從微生物擴(kuò)展到動(dòng)植物，但其中不乏有各種奇怪的項(xiàng)目，遇到各樣匪夷所思的問(wèn)題，也難免有不甚理想的結(jié)果。從中既是體會(huì)到了成長(zhǎng)的痛苦，也感受過(guò)更多開(kāi)花結(jié)果的喜悅。

猛然間，從內(nèi)心流露出一絲希冀，想要證明自己在所愛(ài)的路上，曾經(jīng)努力過(guò)，也終有所得。隨后我將記錄生信道路上的點(diǎn)滴。給眾多想要做好這方面工作的人一個(gè)“彎道超車”的機(jī)會(huì)，希望大家能從中收獲很多。

今天將介紹一下組裝分析的整體框架，后續(xù)會(huì)逐步細(xì)化。

對(duì)于還未做過(guò)基因組組裝的老師，肯定會(huì)有幾個(gè)問(wèn)題要問(wèn)：

• 目前基因組都是怎么做的，我的材料要怎么做。

• 組裝完成后，怎么判斷基因組版本的好壞。

是不是現(xiàn)在腦瓜子嗡嗡的？淡定，我來(lái)幫你解答心中疑問(wèn)。

問(wèn)題1：目前基因組都是怎么做的，我的材料要怎么做？

• 開(kāi)啟基因組項(xiàng)目之前的準(zhǔn)備工作

正所謂“知知己知彼，百戰(zhàn)不殆”。做項(xiàng)目如同作戰(zhàn)一般，要提前做好功課。第一個(gè)要解決的問(wèn)題就是材料的基因組多大，復(fù)雜度如何？因此，做基因組之前強(qiáng)烈推薦做survey和流式，確定一下基因組大小和復(fù)雜度。

在正式進(jìn)行基因組組裝之前，都會(huì)進(jìn)行survey評(píng)估，以此衡量基因組的大小、復(fù)雜度和雜合度。

那么有很多老師問(wèn)，可不可以不做流式呢？答案是不做也行，做了更好。如果基因組不是特別復(fù)雜，survey分析所用的測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠，結(jié)果理想、準(zhǔn)確。那恭喜您！而一旦出現(xiàn)問(wèn)題，在有流式結(jié)果的情況下，就可以用來(lái)驗(yàn)證，特別是在survey結(jié)果出現(xiàn)多峰情況，無(wú)法判定主峰之時(shí)，流式的結(jié)果顯得尤為重要。

• 該如何選擇測(cè)序方案

截至2020年1月份，目前針對(duì)基因組的組裝可采用多種技術(shù)（如下圖）。

圖1 目前各種測(cè)序技術(shù)對(duì)基因組組裝的貢獻(xiàn)

技術(shù)紛繁復(fù)雜，為了獲得染色體級(jí)別組裝的基因組（基因組Plus版），如下操作。

1.技術(shù)選擇

• 第一步，構(gòu)建contig

目前常用的技術(shù)是使用Pacbio和Nanopore技術(shù)進(jìn)行基因組的contig構(gòu)建。

• 第二步， scaffold的構(gòu)建，可選項(xiàng)

一般采用的技術(shù)都是10X genomics和Bionano技術(shù)。這兩種技術(shù)為可選，究其原因?yàn)?0X和Bionano是一種將contig連接成scaffold的過(guò)程，簡(jiǎn)單理解成將組裝好的contig進(jìn)行排序和定向，中間加入預(yù)計(jì)長(zhǎng)度的N。此外，Bionano可預(yù)測(cè)gap的長(zhǎng)度，同時(shí)兼具對(duì)組裝的contig糾錯(cuò)功能，發(fā)現(xiàn)組裝過(guò)程中的錯(cuò)誤，從而打開(kāi)錯(cuò)誤的位置，以備后續(xù)的正確排序和定向。

另外要提及的是，在基因組組裝方面，10X技術(shù)不僅可以用來(lái)構(gòu)建scaffold，同時(shí)測(cè)序深度足夠的話，可以直接進(jìn)行基因組組裝，功能很強(qiáng)大的喲。

• 第三步，Hi-C技術(shù)，必選項(xiàng)

該技術(shù)稱為染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)，準(zhǔn)確度可以媲美早期的遺傳圖譜。一般而言該技術(shù)98%的材料都需要糾錯(cuò)，因此一定要注意選擇合適的合作伙伴，該技術(shù)用在組裝上說(shuō)，可謂是省時(shí)、省心、省錢。

2.策略選擇

目前是Pacbio或ONT選擇其一，10X或者Bionano可選也可不選，主要目的是糾錯(cuò)和把部分contig以gap的形式進(jìn)行初步連接。Hi-C技術(shù)則為必選項(xiàng)，將contig/scaffold連接成染色體級(jí)別。

至此，目前常用組裝技術(shù)已簡(jiǎn)要介紹。那組裝結(jié)果，是“合格品”還是“殘次品”呢？我們接著往下看。

問(wèn)題2：如何評(píng)估組裝結(jié)果的好壞？

一般而言，我們關(guān)注以下幾個(gè)指標(biāo)：1. 基因組大??；2.contig N50；3.回帖率和覆蓋度；4.BUSCO評(píng)估；5.單堿基準(zhǔn)確度。

1.基因組大小

基因組大小一般會(huì)跟survey和流式預(yù)估相差不大，但并非一定如此。這兩種技術(shù)只是一種預(yù)測(cè)基因組大小的方法，所以與真實(shí)基因組大小可能會(huì)存在一定的差異。最終組裝的基因組大小還會(huì)受到材料的雜合度和重復(fù)度的影響。雜合過(guò)高，可能把雜合的區(qū)域也一并組裝出，一般組裝結(jié)果會(huì)可能偏大。重復(fù)度則需要考慮到測(cè)序手段，如果測(cè)序的長(zhǎng)度能夠跨過(guò)重復(fù)區(qū)域，組裝出的基因組大小不會(huì)有很大差異，如果跨不過(guò)去，那很大程度上會(huì)組裝的少些，重復(fù)區(qū)域只能組裝出一部分。

2.contig N50

contig N50，是組裝結(jié)果最直觀的體現(xiàn)。以蘋果的基因組文章為例[zhang, et al., 2019]，利用Pacbio+Hic的技術(shù)，大大提高了基因組的組裝質(zhì)量，其中一個(gè)重要指標(biāo)就是contig N50,比10年發(fā)表在NG上基因組提高了近460倍(contig N50從13k到6.99Mb)，享受了技術(shù)帶來(lái)的福利。

N50是一個(gè)值得關(guān)注的指標(biāo)。下表是桃的基因組文章中統(tǒng)計(jì)了部分物種的組裝質(zhì)量，比較了多個(gè)物種的N50的指標(biāo)。

表1 各植物基因組質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表[Verde, et al., 2013]

那是不是所有材料都會(huì)達(dá)到如此高水平的組裝效果呢？

就目前技術(shù)，針對(duì)不是特別復(fù)雜的基因組，contig N50都可以達(dá)到Mb級(jí)別。這種Mb級(jí)別的contig長(zhǎng)度，針對(duì)基因組組裝后的注釋分析而言，就準(zhǔn)確度和完整度方面足以。因?yàn)閷?duì)于基因組當(dāng)中，這些contig連接不起來(lái)的區(qū)域，一般情況下都是基因組的復(fù)雜區(qū)域，而該區(qū)域包含基因的概率很低，因此對(duì)基因注釋的影響一般不會(huì)很大。

但是，需要注意的是，并非所有物種組裝后的contig N50都會(huì)很高，所以對(duì)這個(gè)值要理性看待。在這幾年的實(shí)踐中，我們遇到過(guò)同樣的技術(shù)、同樣的數(shù)據(jù)量、同樣的算法、不同的材料背景，簡(jiǎn)單的基因組就是比復(fù)雜基因組裝得好。因此基因組的重復(fù)度和雜合度，都會(huì)對(duì)基因組的這個(gè)指標(biāo)造成或大或小的影響。

因此，需要以“盡信值則不如無(wú)值“的理念看到這個(gè)問(wèn)題。當(dāng)出現(xiàn)異常的時(shí)候，積極地去排查，從而才能得到想要的結(jié)果。

3.回帖率和覆蓋度

回帖率指的是將同一材料進(jìn)行二代測(cè)序，將二代數(shù)據(jù)比對(duì)至組裝出的基因組，看有多少數(shù)據(jù)可以比對(duì)回去。一般情況都能高于90%以上（95%屬于平均水平），覆蓋度也會(huì)在90%以上。在這里，我們會(huì)思考這個(gè)數(shù)據(jù)受什么影響呢？

• 1.基因組中雜合區(qū)域的存在。組裝時(shí)雜合的區(qū)域被去掉了，或者沒(méi)有裝出來(lái)，這個(gè)值就會(huì)有所降低。目前都是只裝一套基因組的。因此只要不是特別低，一般情況下說(shuō)明雜合區(qū)域的組裝都沒(méi)有問(wèn)題。

• 2.二、三代測(cè)序技術(shù)本身的缺陷。一般來(lái)說(shuō)，二代數(shù)據(jù)對(duì)基因組的覆蓋度可達(dá)95%以上，那為啥不是100%呢？由于二代測(cè)序技術(shù)本身的缺陷，在建庫(kù)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了PCR過(guò)程，那么PCR的缺點(diǎn)就需要接受。高GC、高重復(fù)區(qū)域不容易被擴(kuò)增出來(lái)，那么基因組中的這部分就很大程度上以未覆蓋的區(qū)域存在，所以回帖率不可能達(dá)到100%。

• 3.技術(shù)的差異。組裝基因組的框架是采用Pacbio技術(shù)，拋開(kāi)組裝錯(cuò)誤來(lái)說(shuō)，一般都不會(huì)到100%。因?yàn)樵摷夹g(shù)在測(cè)序過(guò)程中不經(jīng)歷PCR，因而不會(huì)像二代測(cè)序一般受到PCR的局限，故而可能會(huì)測(cè)到二代測(cè)不到的區(qū)域。由此回帖率也不會(huì)達(dá)到100%。

4.BUSCO評(píng)估

BUSCO是一個(gè)核心單拷貝基因庫(kù)，根據(jù)物種進(jìn)化關(guān)系（界，門，綱等）構(gòu)建各種單拷貝基因的數(shù)據(jù)庫(kù)。該庫(kù)可以用來(lái)評(píng)估基因組的核心基因是否均組裝出。如下圖所示，已發(fā)表物種都在85%以上。

圖2 基因組和基因的BUSCO評(píng)估 [Waterhouse, et al., 2017]

一般情況下，基因組評(píng)估均能達(dá)到90%以上。所以這個(gè)值的含金量就會(huì)降低，但是就當(dāng)前現(xiàn)狀來(lái)說(shuō)并未有其他更理想的可替代的評(píng)估策略。因此，目前大家還都作為組裝后例行評(píng)估而采用。

然而組裝出的基因組效果是層次不齊。可能讀者會(huì)有疑問(wèn)，如果我的評(píng)估結(jié)果很低的時(shí)候該怎么辦呢？不要急，我們來(lái)分析一下可能的原因。

物種原因。BUSCO是根據(jù)目前發(fā)表物種依據(jù)序列相似度而整理出的一些核心基因集。若研究材料已知信息較少，那么該分析則會(huì)存在偏差，參考意義較小。

如果出現(xiàn)上述情況，怎么辦呢？可將該物種表達(dá)的基因測(cè)出，比對(duì)到基因組上，看有多少基因序列能夠以高覆蓋度的形式存在。如果95%以上的EST都可以90%的覆蓋度比對(duì)回去，那組裝結(jié)果一定程度上是可信的。

第二種則是組裝結(jié)果不良。如果二代數(shù)據(jù)回帖率評(píng)估不過(guò)關(guān)、比對(duì)率較低，側(cè)面說(shuō)明有很多區(qū)域沒(méi)有組裝出來(lái)而導(dǎo)致組裝效果差。

5.單堿基準(zhǔn)確度

一般這種方法針對(duì)二倍體材料可以采用。將在糾錯(cuò)階段未使用的另一批二代數(shù)據(jù)比對(duì)回基因組，進(jìn)行SNP calling。對(duì)于二倍體而言，某些位點(diǎn)應(yīng)該最多有兩種堿基型，如果鑒定到的變異位點(diǎn)ref的類型沒(méi)有數(shù)據(jù)支持，或者該位點(diǎn)有多種堿基類型，那該位點(diǎn)很大概率上是有問(wèn)題的。

結(jié)語(yǔ)

上述長(zhǎng)篇大論相信大家對(duì)于組裝整體框架有了一個(gè)感官的了解和認(rèn)識(shí)，在此恭喜大家，入門了。此時(shí)是否有更多的疑惑溢出，比如 Pacbio和Nanopore如何選擇呢？如何構(gòu)建染色體級(jí)別的染色體呢？別急，欲知后事如何，且看下回分解。

參考：

Verde I, Abbott A G, Scalabrin S, et al. The high-quality draft genome of peach (Prunus persica) identifies unique patterns of genetic diversity, domestication and genome evolution[J]. Nature genetics, 2013, 45(5): 487.

Waterhouse R M, Seppey M, Sim?o F A, et al. BUSCO applications from quality assessments to gene prediction and phylogenomics[J]. Molecular biology and evolution, 2017, 35(3): 543-548.

Zhang L, Hu J, Han X, et al. A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1494.

作者：hony
審稿：童蒙
編輯：angelica