一、原位雜交技術(shù)的定義與科學(xué)價(jià)值

原位雜交組織（細(xì)胞）化學(xué)（In Situ Hybridization, ISH）是基于核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，利用標(biāo)記核酸探針與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸（DNA/RNA）特異性結(jié)合，通過(guò)可視化檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)核酸原位定位的分子病理學(xué)技術(shù)。該技術(shù)可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定性、定位及定量分析，尤其在低豐度 mRNA 與罕見(jiàn)基因表達(dá)分析中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，已成為分子生物學(xué)與病理學(xué)交叉領(lǐng)域的核心技術(shù)之一。

二、原位雜交的分類

根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類，其穩(wěn)定性依次增大。

根據(jù)探針的標(biāo)記物是否具有放射性，原位雜交又可分為同位素標(biāo)記探針?lè)ê头峭凰貥?biāo)記探針?lè)▋深?。同位素?biāo)記探針?lè)ㄊ怯梅派湫酝凰貥?biāo)記探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后可用敏感性高的放射自顯影技術(shù)檢測(cè)。常用的放射性同位素如3H、32P、35S、125I等。非同位素標(biāo)記探針?lè)ㄒ话阌冒肟乖瓨?biāo)記探針，如生物素（Biotin）、地高辛素（DIG）等，最后通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。

原位雜交最初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的，這種方法敏感性高，但核素具有半衰期限制、放射性污染且該方法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員具有輻射危害。而非同位素標(biāo)記探針雖然在敏感性方面不如同位素標(biāo)記探針，但其穩(wěn)定性和分辨力高，檢測(cè)時(shí)間短，一般在24h即可得到結(jié)果，同時(shí)操作簡(jiǎn)便，沒(méi)有放射性污染的安全問(wèn)題。因此，非同位素標(biāo)記探針(尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針)迅速發(fā)展，逐漸成為原位雜交技術(shù)的主流方法，更受科技工作者的關(guān)注與青睞。

三、原位雜交選擇指南

1、生物素標(biāo)記探針or地高辛標(biāo)記探針?

地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物中提取的類固醇物質(zhì)——Digoxigenin（DIG）。由于Digoxigenin在自然界中來(lái)源單一，因此抗DIG的抗體不會(huì)與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標(biāo)記的需要。同樣是小分子標(biāo)記物，生物素廣泛存在于各種組織中，對(duì)于靈敏度很高的標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，樣品自身含有的內(nèi)源生物素，就會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。地高辛就能夠很好地避免這個(gè)問(wèn)題。

2、PCR法or隨機(jī)引物法?

如果有足夠量的高純度模板，可以采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法。而當(dāng)只能獲得有限量模板，或模板僅僅部分純化，或模板非常短時(shí)，PCR標(biāo)記是制備DIG標(biāo)記探針的優(yōu)選方法。它比其他方法需要更少的優(yōu)化，且標(biāo)記探針產(chǎn)量高。在PCR標(biāo)記過(guò)程中，熱穩(wěn)定聚合酶會(huì)在擴(kuò)增模板DNA特定區(qū)域時(shí)結(jié)合DIG-dUTP。其生成的是高度標(biāo)記、非常特異、且非常敏感的雜交探針。

市場(chǎng)上主要使用隨機(jī)引物法的試劑盒如羅氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 和II，標(biāo)記效率較高；主要使用PCR法的試劑盒如常州百代生物的BIOG地高辛標(biāo)記試劑盒，盒內(nèi)特別的采用了超級(jí)熱啟動(dòng)Taq酶，大幅提升了探針的雜交活性，與隨機(jī)引物法相比，具有非常顯著的性能優(yōu)勢(shì)，可以通過(guò)雜交檢測(cè)到極低拷貝甚至是單拷貝基因。

3、地高辛標(biāo)記的探針免疫酶學(xué)檢測(cè)方法Dig –HRPor Dig –AKP？

常用的免疫酶學(xué)檢測(cè)方法有兩類：

·Dig –HRP（辣根過(guò)氧化物酶）檢測(cè)體系：以DAB（四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺）/H2O2為底物，結(jié)果為棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。????

·Dig –AKP（堿性磷酸酶）檢測(cè)體系：以BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀。

與免疫細(xì)胞化學(xué)方法相似，如應(yīng)用酶促反應(yīng)會(huì)較單一信號(hào)的標(biāo)記物如熒光素具有更高的靈敏度。同樣是酶促化學(xué)反應(yīng)，AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右。以BIOG地高辛標(biāo)記探針原位雜交檢測(cè)小鼠肝臟組織漢坦病毒感染為例（圖1），以堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，與組織細(xì)胞中通過(guò)原位雜交定位結(jié)合的地高辛標(biāo)記探針高效結(jié)合，再通過(guò)NBT/BCIP顯色，即可靈敏準(zhǔn)確地展示出所要檢測(cè)的靶基因及其細(xì)胞定位，可廣泛用于組織原位雜交、細(xì)胞原位雜交和染色體原位雜交等。