一、Solexa測(cè)序技術(shù)前世今生（——Illumina平臺(tái)）

Solexa高通量測(cè)序技術(shù)是由英國(guó)劍橋大學(xué)派生的Solexa公司建立起來(lái)的。該方法以單分子陣列技術(shù)為基礎(chǔ)，是對(duì)合成測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與延伸。

二、測(cè) 序 原 理

Solexa是一種基于邊合成邊測(cè)序技術(shù)（Sequencing-By-Synthesis，SBS）的新型測(cè)序技術(shù)。通過單分子陣列實(shí)現(xiàn)在小型芯片（FlowCell）上進(jìn)行橋式PCR反應(yīng)。通過可逆阻斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)每次只合成一個(gè)堿基，再利用相應(yīng)的激光激發(fā)熒光集團(tuán)，捕獲激發(fā)光，從而讀取堿基信息。

1）Flow Cell結(jié)構(gòu)

Flow Cell結(jié)構(gòu)示意圖

2）可逆阻斷技術(shù)

可逆阻斷原理示意圖

3）邊合成邊測(cè)序（SBS）

邊合成邊測(cè)序示意圖

a.加入測(cè)序引物

b.Cycles1

a)合成第一個(gè)堿基

b)清除未反應(yīng)的堿基和試劑

c)激發(fā)熒光信號(hào)并讀取 （可逆阻斷技術(shù)的步驟）

d)去除熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán) （可逆阻斷技術(shù)的步驟）

c.Cycle2……Cycle n

4）橋式PCR（——簇生成之“起始延伸”）

起始延伸步驟示意圖

5）橋 式 PCR（——簇生成之“擴(kuò)增”）

簇生成示意圖

6）橋 式 PCR（——簇生成之“測(cè)序”）

測(cè)序示意圖

7）堿基讀取

堿基讀取示意圖

三、工作流程

四、測(cè) 序 類 型

a)單端測(cè)序（single-read sequencing，SR）

b)雙端測(cè)序（Paired-endsequencing，PE）

c)混樣測(cè)序（Indexsequencing）

1）FollowCell 接頭差異

Paired End

Paired End

Uracil Specific Excision Reagent (USER)

尿嘧啶切割位點(diǎn)

FormamidopyrimidineGlycosylase (fpg)

糖基化酶切割位點(diǎn)

Single Read

Single Read

Periodate Linearization

高碘酸鹽切割位點(diǎn)

a）雙 端 測(cè) 序

Paired-End sequencing（PE/雙端測(cè)序）

?檢測(cè)基因片段兩端的基因信息。

雙端測(cè)序示意圖

b）單 端 測(cè) 序

Single-read sequencing（SR，單端測(cè)序）

?只檢測(cè)基因片段一段的基因信息。

單端測(cè)序示意圖

c）混 樣 測(cè) 序

Index Sequencing：將多種樣本混合測(cè)序

?充分利用solexa高通量測(cè)序特點(diǎn)。

混樣測(cè)序示意圖

A：Adapter

B：Fragment DNA

C：Index seq primer

D：Index

E：Adapter

測(cè)序過程示意圖

五、儀 器 構(gòu) 造

1）Miseq測(cè)序儀

Miseq測(cè)序儀示意圖

Hiseq側(cè)測(cè)序儀

六．測(cè)序結(jié)果展示

Fastq：Fastq是Solexa測(cè)序技術(shù)中一種反映測(cè)序序列的堿基質(zhì)量的文件格式。

?Read 1

Read1測(cè)序結(jié)果示意圖

?Read 2

Read2測(cè)序結(jié)果示意圖

堿基質(zhì)量示意圖

測(cè)序結(jié)果的解釋