文 南京大學 楊榮武教授

層析在蛋白質分離純化中是不可替代的一種方法，早在1903年，層析法就被俄國植物學家Mikhail Tswett 用來分離植物色素，因此又稱為色譜。所有的層析系統(tǒng)都由兩相組成：一個是固定相（stationary phase），它可以是固體物質，也可以是固定在固體物質上的成分；另一個是由可以流動的物質組成的流動相（mobile phase），如水和各種溶劑。當待分離樣品隨著流動相通過固定相時，各組分在理化性質上的差別使得各自與兩相發(fā)生相互作用（如吸附、溶解或結合等）的能力不同，最終導致它們在兩相中的分配不同，而且隨著流動相向前移動，各組分會不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動相移動時受到的阻力就越小，向前移動的速度越快；反之，與固定相相互作用越強的組分，向前移動速度越慢。經(jīng)過分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到分離各組分的目的。

常見的層析方法有：離子交換層析（ion exchange chromatography）、疏水層析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、親和層析（affinity chromatography）、凝膠過濾層析（gel filtration chromatography）。

1）離子交換層析

離子交換層析是以含有帶電基團的樹脂作固定相，利用它與流動相中帶相反電荷的離子結合并進行可逆交換的性質來分離目標帶電分子的一種方法。如果進行可逆交換的離子是陽離子，則為陽離子交換層析；反之，則稱為陰離子交換層析。在進行離子交換層析時，首先需要用幾倍于柱體積的低鹽緩沖溶液對樹脂進行平衡；然后在低鹽條件下，將樣品上柱，與樹脂帶相反電荷的分子會通過靜電作用與樹脂結合，而不帶電荷的或帶相同電荷的分子直接流出 ；最后，用高鹽緩沖溶液洗脫，以取代與樹脂結合的分子。

2）疏水作用層析

疏水作用層析是利用不同蛋白質在疏水性質上的差別，而對特定蛋白質進行純化的一項層析技術。其固定相是連接到惰性基質上的疏水基團，如苯環(huán)。其原理類似于鹽析，即在高離子強度下樣品上柱（如1 mol·L-1硫酸銨），以此除去蛋白質的水化層，因而表面上親水基因最少的蛋白質最容易失去水，也就最容易暴露出它們的疏水基團，并與樹脂上的疏水基團結合；反之，表面上親水基團最多的蛋白質最難失去水化層，也就最難與固定相結合。

HIC的洗脫方法有：降低洗脫液的鹽濃度、增加洗脫液的去污劑濃度或者改變pH。

3）凝膠過濾層析

凝膠過濾層析又稱分子篩過濾層析（molecular sieve chromatography）或大小排阻層析（size exclusion chromatography）等，是一種按大小來分離物質（分子形狀也起一定作用）的層析方法。其固定相是裝在層析柱內細而多孔的凝膠顆粒，如葡聚糖（Sephadex），在將樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱以后，使用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒的內部，只能存在于凝膠顆粒之間的流動相，因而以較短的路徑和較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒內部，并很快在兩相之間形成動態(tài)平衡，于是要走更長的路徑和花費更長的時間流過柱床，不同大小的分子因此得以分離。

4）親和層析

親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異性的親和力，而實現(xiàn)分離的一類特殊層析技術。其固定相是惰性的帶有共價偶聯(lián)配體的樹脂，當含有混合組分的樣品通過此固定相時，只有和固定相上的配體具有特異親和力的物質，才能被固定相吸附結合，其他沒有親和力的無關組分就隨流動相流出。如果改變流動相成份，可將結合的親和物洗脫下來。洗脫的方法有：增加游離配體的濃度或改變pH。

可用于親和層析的具有特異性親和力的生物分子對（蛋白質-配體）主要有：酶與底物/抑制劑；受體與激素；抗體與抗原；抗體與蛋白質A；帶有His標簽的融合蛋白與金屬鎳；帶有GST標簽的融合蛋白與谷胱甘肽；蛋白質與染料；糖蛋白與植物凝集素（lectin）；其他特異性結合蛋白與被結合的物質。

親和層析純化過程簡單、迅速、高效，有時能夠“一柱到位”，對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質特別有效。