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測(cè)序知識(shí).png

測(cè)序過(guò)程和原理

一代測(cè)序（Sanger測(cè)序）

原理：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過(guò)程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來(lái)中斷DNA合成反應(yīng)。在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通過(guò)凝膠電泳分離和放射自顯影后識(shí)別確定待測(cè)分子的DNA序列。

特點(diǎn)：讀長(zhǎng)長(zhǎng)（1000 bp），準(zhǔn)確性高（99.999%），通量低。

二代測(cè)序（NGS測(cè)序）

原理：邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis，SBS）
在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。

特點(diǎn)：通量高、時(shí)間短、讀長(zhǎng)短。
平臺(tái)介紹
Roche公司的454技術(shù)、
Illumina公司的Solexa技術(shù)
Life technologies（ABI）公司的SOLiD技術(shù)（Ion Torrent和Ion Proton）
流程

DNA文庫(kù)構(gòu)建
將基因組DNA隨機(jī)片段化，然后通過(guò)末端修復(fù)、磷酸化、加A等步驟修補(bǔ)成平末端，最后加上特定的接頭（Adaptor），構(gòu)建成DNA文庫(kù)。
簇的生成——橋式PCR
Flowcel上面連有兩種接頭（P5、P7），當(dāng)DNA經(jīng)變性后流經(jīng)Flowcell時(shí)，利用Flowcell上的接頭與DNA兩端的接頭相互匹配。DNA進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，從而將堿基信號(hào)放大。通過(guò)橋式PCR不斷循環(huán)獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。
測(cè)序
數(shù)據(jù)產(chǎn)出

三代測(cè)序

原理：

SMRT技術(shù)：
也采用邊合成邊測(cè)序方法，以SMRT芯片為測(cè)序載體，芯片上眾多小孔中的DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標(biāo)記4種堿基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在堿基配對(duì)階段，加入不同堿基會(huì)發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類(lèi)型。另外，若堿基存在修飾，則通過(guò)聚合酶的速度會(huì)減慢，因此可以通過(guò)檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間、兩峰之間的距離來(lái)檢測(cè)甲基化等堿基修飾情況。SMRT測(cè)序速度快（每秒約數(shù)個(gè)dNTP），但是，測(cè)序錯(cuò)誤率也較高（達(dá)到15%，可通過(guò)多次測(cè)序進(jìn)行有效的糾錯(cuò)）。

納米孔單分子測(cè)序技術(shù)：
該技術(shù)的原理是當(dāng)在膜兩側(cè)施加電壓，分子馬達(dá)驅(qū)動(dòng)DNA分子通過(guò)納米孔，導(dǎo)致電荷發(fā)生變化，每種堿基引起的電流變化是不同的，通過(guò)檢測(cè)這些電流進(jìn)而轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的堿基序列。

特點(diǎn)：無(wú)需PCR擴(kuò)增，讀長(zhǎng)長(zhǎng)，無(wú)視GC含量的影響。
平臺(tái)
PacBio 實(shí)時(shí)單分子測(cè)序
Complete Genomics公司的復(fù)合探針-錨定連接技術(shù)
Oxford Nanopore 納米孔單分子通道技術(shù)
Ion Torrent電子流檢測(cè)技術(shù)
注：以上內(nèi)容均摘自微信公眾號(hào) “生信星球”

選修

Filezilla能干什么？

（1）你的電腦和你的服務(wù)器之間互傳文件
（2）從數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)到你的電腦（然后傳到你自己的服務(wù)器）

Filezilla是什么？

（1）filezilla是圖形界面的FTP工具
（2）FTP--File Transfer Protocol，文件傳輸協(xié)議。
下載公共數(shù)據(jù)庫(kù)里的數(shù)據(jù)。
SFTP---SecureFile Transfer Protocol，安全文件傳送協(xié)議。
自己電腦和自己服務(wù)器互傳。