來源：https://mp.weixin.qq.com/s/iBX913ad3nVOT4oyZpsZzA
基因talks [e藥安全](javascript:void(0);) 9月28日
ctDNA（circulating tumor DNA） 是腫瘤細(xì)胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的 DNA，是循環(huán)游離 DNA（circulating free DNA，cfDNA）或細(xì)胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）的一部分。ctDNA檢測(cè)（液體活檢）相對(duì)于常規(guī)傳統(tǒng)侵入式實(shí)體組織活檢具有非侵入性，患者依從性好，異質(zhì)性低，可反復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)。
▲ 液體活檢 vs 組織活檢
臨床上，由于ctDNA的半衰期短、濃度及含量低等原因，所以ctDNA檢測(cè)需要高靈敏度的技術(shù)。目前，實(shí)驗(yàn)室常見的ctDNA檢測(cè)技術(shù)有：
? 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（ARMS-PCR）；
? 核酸質(zhì)譜（MassARRAY）；
? 液滴數(shù)字PCR（ddPCR）；
? 二代測(cè)序（NGS）等。1
*（文末有彩蛋）
2019年6月10日發(fā)表于癌癥雜志上的一篇研究，對(duì)比了分析了肺腺癌患者血漿ctDNA的兩種EGFR檢測(cè)方法：ARMS-PCR vs SABER/MassARRAY （Cancers (Basel), 2019, 11(6): 803. IF=6.162）。結(jié)果顯示：
? ARMS-PCR vs SABER/MassARRAY檢測(cè)血漿ctDNA中EGFR突變的總體靈敏度和特異性分別為：49.1% vs 56%，90% vs 95%。兩種方法之間的一致性水平非常高，kappa值為 0.88（95％CI 0.77-0.99）。
? 一線EGFR-TKI治療后血漿ctDNA中EGFR突變的存在與預(yù)后不良有關(guān)（PFS：9.0個(gè)月 vs 15.0個(gè)月；OS：30.6個(gè)月 vs 55.6個(gè)月），可見ctDNA適合作為腫瘤實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)及腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后早期預(yù)警指標(biāo)。2
▲ 肺腺癌患者血漿ctDNA兩種EGFR檢測(cè)方法對(duì)比（IF=6.162）
1關(guān)鍵詞基礎(chǔ)介紹
? EGFR與肺癌診療的關(guān)系：表皮生長因子受體（EGFR）通路在各種實(shí)體瘤（包括NSCLC）的生長，增殖和存活中起重要作用，因此，EGFR是肺癌治療的重要潛在靶標(biāo)。
▲ （詳情點(diǎn)擊圖片查看）
? ARMS-PCR：擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）。
▲ （詳情點(diǎn)擊圖片查看）
? SABER/MassARRAY：****單等位****基因堿基延伸反應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜分析（single allele base extension reaction combined with mass spectroscopy，SABER/MassARRAY）。
▲ （詳情點(diǎn)擊圖片查看）
2研究流程及結(jié)果
? 研究流程：在本前瞻性研究中，研究者們使用肺腺癌患者的組織樣本確定EGFR突變狀態(tài)，并比較了ARMS和SABER/MassARRAY方法檢測(cè)從這些患者血漿中分離的ctDNA中EGFR突變的效率。同時(shí)，還評(píng)估了接受一線EGFR-TKI治療的肺腺癌患者的EGFR狀態(tài)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系。
▲ 研究流程圖
? 研究樣本數(shù)：2013年2月~2017年3月，77名肺腺癌患者（57名患者和20名沒有EGFR突變者）。
? EGFR檢測(cè)內(nèi)容：包括19del、L858R及T790M等。
? ARMS檢測(cè)試劑：therascreen EGFR RGQ PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany) ，可以檢測(cè)組織和血漿ctDNA。該試劑盒已在美國以及歐洲和亞洲國家獲得批準(zhǔn)，用于高靈敏度和特異性的檢測(cè)肺癌組織/血漿ctDNA中的EGFR突變。3
? MassARRAY檢測(cè)試劑：OncoFOCUS? Panel v1.0（Agena Bioscience，San Diego，SABER / MassARRAY）。MassARRAY系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（MALDI-TOF）的中通量多重超靈敏突變檢測(cè)系統(tǒng)，可檢測(cè)實(shí)體瘤患者血漿ctDNA突變。4
? 組織DNA抽提：使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen）試劑盒從5um厚的FFPET中提取DNA。
? 血漿ctDNA抽提****：使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen）試劑盒從EDTA管采集的1ml血漿中提取ctDNA。
? 研究結(jié)果：
首先使用ARMS方法確定77名肺腺癌患者組織樣本EGFR突變狀態(tài)：57名患者EGFR突變，20名患者EGFR野生型。然后，使用ARMS和SABER/MassARRAY方法分別檢測(cè)從77和70名患者血漿中分離的ctDNA中EGFR突變狀態(tài)，并評(píng)估接受一線EGFR-TKI治療的肺腺癌患者的EGFR狀態(tài)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系。
① EGFR的檢測(cè)：以肺腺癌患者組織樣本的EGFR突變狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)，ARMS和SABER/MassARRAY檢測(cè)血漿ctDNA中EGFR突變的總體靈敏度、特異性及陽性預(yù)測(cè)值（PPV）分別為：49.1% vs 56%，90%vs 95%，93.3% vs 96.6%。
▲ 兩種方法檢測(cè)EGFR對(duì)比
②** 19del的檢測(cè)：ARMS和SABER/MassARRAY檢測(cè)血漿ctDNA中EGFR 19del突變的總體靈敏度、特異性及陽性預(yù)測(cè)值（PPV）分別為：50％ vs 53.8％，95.6％ vs 97.7％，88.9％ vs 93.3％。**
▲ 兩種方法檢測(cè)EGFR 19del對(duì)比
③** L858R的檢測(cè)：ARMS和SABER/MassARRAY檢測(cè)血漿ctDNA中EGFR L858R突變的總體靈敏度、特異性及陽性預(yù)測(cè)值（PPV）分別為：45％ vs 47.4％，100％ vs 100％，100％ vs 100％。**
▲ 兩種方法檢測(cè)EGFR L858R對(duì)比
④ T790M的檢測(cè)：在一名患者的血漿ctDNA中檢測(cè)到與EGFR-TKI耐藥相關(guān)的T790M突變，而在EGFR-TKI治療失敗的5名患者的再活檢樣本中也檢測(cè)到T790M突變。ARMS和SABER/MassARRAY檢測(cè)血漿ctDNA中EGFR T790M突變的總體靈敏度、特異性及陽性預(yù)測(cè)值（PPV）分別為：33.3％ vs 50％，100％ vs 100％，100％ vs 100％。
▲ 兩種方法檢測(cè)EGFR T790M對(duì)比
⑤ EGFR突變與預(yù)后關(guān)系：參加研究的77名患者中，43例組織檢測(cè)到常見EGFR激活突變（L858R和19del）并接受一線EGFR-TKI治療，在這43例患者中，血漿ctDNA 中EGFR突變的存在與預(yù)后不良有關(guān)（PFS：9.0個(gè)月 vs 15.0個(gè)月；OS：30.6個(gè)月 vs 55.6個(gè)月****），可見ctDNA適合作為實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)及腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后早期預(yù)警指標(biāo)。
▲ EGFR-TKI治療后，血漿EGFR突變存在與預(yù)后PFS及OS有關(guān)
43例患者中，在預(yù)后評(píng)估方面，34例ARMS患者和30例SABER/MassARRAY患者在檢測(cè)血漿ctDNA EGFR突變時(shí)，使用胸部 CT 檢測(cè)腫瘤的大小，發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI治療后血漿EGFR突變存在的患者腫瘤較EGFR野生型的患者腫瘤更大。
▲ EGFR-TKI治療后血漿EGFR突變存在的患者腫瘤更大
3研究討論及結(jié)論
討論：
① 本次研究的 ARMS 靈敏度（49.1%）較先前報(bào)道的略低（43.1~85.7%）5,6,7，可能原因是研究設(shè)計(jì)的問題：血液樣本是在EGFR-TKI治療后采集的。事實(shí)上，之前的一項(xiàng)研究報(bào)道，化療或EGFR-TKI治療后，肺癌患者血漿ctDNA 中EGFR突變的檢出率較低。8
② SABRE/MassARRAY是檢測(cè)EGFR 19del 和 L858R 突變可靠且靈敏的方法。SABER/MassARRAY的靈敏度略高于ARMS（56％ vs 49.1％），其中19del的靈敏度（53.8％ vs 50％），L858R的靈敏度（47.4％ vs 45％），T790M的靈敏度（50％ vs 33.3％）均略高于ARMS，可能與其ctDNA突變檢測(cè)下限有關(guān)（SABRE/MassARRAY為0.1％，ARMS為1％）。9 （需要注意的是：Agena官方顯示本研究中使用的 MassARRAY OncoFOCUS? Panel v1.0 是較早的panel，是用 iPLEX Pro 試劑做的，官方靈敏度為 5%；組織 iPLEX HS 是 1%靈敏度，血液 UltraSEEK 是 0.1%靈敏度。所以實(shí)際對(duì)比的應(yīng)該是 5%靈敏度的MassARRAY vs 1%靈敏度的ARMS）
結(jié)論：
此項(xiàng)研究表明，使用ARMS或SABER/MassARRAY方法檢測(cè)血漿ctDNA中EGFR突變是有前景，微創(chuàng)和可靠的，是腫瘤組織活檢替代方法。此外，研究數(shù)據(jù)表明，作為治療隨訪的一部分，監(jiān)測(cè)血漿ctDNA中EGFR突變狀態(tài)可用作攜帶常見EGFR激活突變和接受一線EGFR-TKI治療的肺腺癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。
前面我們說了，目前，實(shí)驗(yàn)室常見的ctDNA檢測(cè)技術(shù)有：
? 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（ARMS-PCR）；
? 核酸質(zhì)譜（MassARRAY）；
? 液滴數(shù)字PCR（ddPCR）；
? 二代測(cè)序（NGS）等。
那么，這四種ctDNA檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，有什么區(qū)別呢？下面我們從產(chǎn)品供應(yīng)商，技術(shù)，突變報(bào)道情況，靈敏度，檢測(cè)周期，優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)角度看看。
MassARRAY UltraSEEKTM
聽說，MassARRAY推出了新的液體活檢技術(shù)：****UltraSEEKTM，靈敏度≥0.1%，一起來了解下：
① MassARRAY系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（MALDI-TOF）的中通量多重超靈敏突變檢測(cè)系統(tǒng)。MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)原理：
② MassARRAY系統(tǒng)有自動(dòng)化和半自動(dòng)化工作流程：
③ MassARRAY UltraSEEKTM 檢測(cè)原理：Agena核酸質(zhì)譜技術(shù)，不需要在檢測(cè)覆蓋度與靈敏度之間進(jìn)行平衡，在UltraSEEK試劑的幫助下可實(shí)現(xiàn)低至0.1%的最小等位基因頻率（MAF）的檢測(cè)。為了獲得高靈敏度，UltraSEEK利用的是多重PCR，并結(jié)合后續(xù)的突變特異性單堿基延伸和帶有鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠進(jìn)行捕獲，內(nèi)置的對(duì)照可用于驗(yàn)證反應(yīng)中是否存在DNA模板。
參考資料：
1.《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)踐中的專家共識(shí) 》
2.Hung M S, Lung Jr H, Lin Y C, et al. Comparative Analysis of Two Methods for the Detection of EGFR Mutations in Plasma Circulating Tumor DNA from Lung Adenocarcinoma Patients[J]. Cancers, 2019, 11(6): 803.
3.Vallee, A.; Le Loupp, A.G.; Denis, M.G. Efficiency of the Therascreen(R) RGQ PCR kit for the detection of EGFR mutations in non-small cell lung carcinomas. Clin. Chim. Acta. 2014, 429, 8–11.
4.Mehrotra, M.; Singh, R.R.; Loghavi, S.; Duose, D.Y.; Barkoh, B.A.; Behrens, C.; Patel, K.P.; Routbort, M.J.; Kopetz, S.; Broaddus, R.R.; et al. Detection of somatic mutations in cell-free DNA in plasma and correlation with overall survival in patients with solid tumors. Oncotarget 2018, 9, 10259–10271.
5.Kimura, H.; Suminoe, M.; Kasahara, K.; Sone, T.; Araya, T.; Tamori, S.; Koizumi, F.; Nishio, K.; Miyamoto,K.; Fujimura, M.; et al. Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serum DNA as a predictor of response to gefitinib (IRESSA). Br. J. Cancer. 2007, 97, 778–784.
6.Wang, S.; Han, X.; Hu, X.; Wang, X.; Zhao, L.; Tang, L.; Feng, Y.; Wu, D.; Sun, Y.; Shi, Y. Clinical significance of pretreatment plasma biomarkers in advanced non-small cell lung cancer patients. Clin. Chim. Acta. 2014, 430, 63–70.
7.Liu, X.; Lu, Y.; Zhu, G.; Lei, Y.; Zheng, L.; Qin, H.; Tang, C.; Ellison, G.; McCormack, R.; Ji, Q. The diagnostic accuracy of pleural effusion and plasma samples versus tumour tissue for detection of EGFR mutation in patients with advanced non-small cell lung cancer: Comparison of methodologies. J. Clin. Pathol. 2013, 66, 1065–1069.
8.Zhang, C.; Wei, B.; Li, P.; Yang, K.; Wang, Z.; Ma, J.; Guo, Y. Prognostic value of plasma EGFR ctDNA in NSCLC patients treated with EGFR-TKIs. PloS ONE 2017, 12, e0173524.
9.Ellison, G.; Donald, E.; McWalter, G.; Knight, L.; Fletcher, L.; Sherwood, J.; Cantarini, M.; Orr, M.; Speake,G. A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples. J. Exp.Clin. Cancer Res. 2010, 29, 132.
推薦閱讀
肺癌，精準(zhǔn)醫(yī)療系列文章肺癌，臨床試驗(yàn)招募匯總
NCCN丨非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南2020.6版①
NCCN丨非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南2020.6版②
NCCN丨小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南2020.3版
NCCN丨免疫治療相關(guān)毒性的管理指南2020.1版①
NCCN丨免疫治療相關(guān)毒性的管理指南2020.1版②
NCCN丨癌癥相關(guān)感染的預(yù)防和治療指南2020.2版①
NCCN丨癌癥相關(guān)感染的預(yù)防和治療指南2020.2版②
加微信號(hào)：251170937，方便免費(fèi)咨詢和尋找最合適的免費(fèi)治療項(xiàng)目
