新手，剛做完一個(gè)ChIP-Seq項(xiàng)目的分析，來記錄一下，會(huì)分好幾篇。
首先是下機(jī)數(shù)據(jù)fastqc之后會(huì)生成一個(gè)html格式的報(bào)告，根據(jù)報(bào)告可以看出自己數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，便于之后clean的參數(shù)設(shè)置。以下是fastqc（v0.11.5）報(bào)告的內(nèi)容說明（以自己的數(shù)據(jù)為例，經(jīng)公司粗過濾后的下機(jī)數(shù)據(jù)）有網(wǎng)上搜索到的也有自己的體會(huì)：
basic?statistics：
基本信息
Per base sequence quality：
堿基質(zhì)量，F(xiàn)red值=-10*log10(p)；p為某堿基測錯(cuò)的概率，若quality是20則概率為0.01，一般集中在30-40；如圖橫軸代表位置，縱軸quality。紅線表示中位數(shù)，藍(lán)線是平均數(shù)，觸須是10%-90%區(qū)間，黃色是25%-75%區(qū)間（此圖沒有）；若任一位置的下四分位數(shù)低于10或中位數(shù)低于25，報(bào)"WARN"；若任一位置的下四分位數(shù)低于5或中位數(shù)低于20，報(bào)"FAIL".
Per?tile Sequence Quality：
橫軸是位置，縱軸是tile的index編號(hào)，熱圖顏色淺代表質(zhì)量低。當(dāng)某些tile出現(xiàn)暖色時(shí)，后續(xù)分析應(yīng)把該tail測序結(jié)果全部去除。
這一模塊是檢查reads中每一個(gè)堿基位置在不同的測序小孔之間的偏離度，藍(lán)色表示低于平均偏離度，越紅則說明偏離平均質(zhì)量方差越多，也就是說質(zhì)量越差。如果出現(xiàn)質(zhì)量問題可能是短暫的，如有氣泡產(chǎn)生，也可能是長期的，如在某一小孔中存在殘骸。問題不大。
per?sequence?quality?scores：
橫軸是質(zhì)量Q值，縱軸是對應(yīng)的reads數(shù)目。主要集中在高分，證明測序質(zhì)量好。
Per Base Sequence Content：
所有reads每一個(gè)位置的堿基分布?？v軸為百分比。ATCG出現(xiàn)的頻率應(yīng)該接近，且沒有位置差異，四條線應(yīng)該平行且接近。當(dāng)部分位置堿基的比例出現(xiàn)bias時(shí)，往往是有overrepresented sequence的污染。當(dāng)所有位置的堿基比例一致的表現(xiàn)出bias時(shí)，即四條線平行但分開，往往代表文庫有bias (建庫過程或本身特點(diǎn))，或者是測序中的系統(tǒng)誤差。 當(dāng)任一位置的A/T比例與G/C比例相差超過10%，報(bào)"WARN"；當(dāng)任一位置的A/T比例與G/C比例相差超過20%，報(bào)"FAIL"。
per?sequence GCcontent：
紅色是實(shí)際值，若出現(xiàn)雙峰，則是混入了其它DNA。
per?base N?content：
測序儀不能分辨的堿基為N，若超過5%則WARN，超過20%則FAIL。
sequence?length?distribution：
理論上每次測序儀測出的read長度一致，但由于建庫等因素通常會(huì)導(dǎo)致一些小片段，如果報(bào)FAIL，表明此次測序過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不可信。未過濾之前如圖一，clean之后會(huì)出現(xiàn)圖二，越短的reads越少，不會(huì)正態(tài)分布。
sequence?duplication?levels：
序列完全一致的reads的頻率。橫軸表示重復(fù)的次數(shù)，縱軸表示重復(fù)的reads的數(shù)目（ 以u(píng)nique reads的總數(shù)作為100%）。一般測序深度越高，越容易產(chǎn)生一定程度的重復(fù)序列。但是read越長越不容易完全重復(fù)（測序錯(cuò)誤、偏差等原因），所以重復(fù)程度可能是低估的。
overrepresented?sequences：
No。指有某個(gè)序列大量出現(xiàn)（fastqc的標(biāo)準(zhǔn)是0.1%以上）一般有在前面GC圖能看出來。
adapter?content：
橫軸表示堿基位置，縱軸表示百分比。當(dāng)fastqc分析時(shí)沒有選擇參數(shù)-a adapter list時(shí)，默認(rèn)使用圖例中的4種通用adapter序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若有adapter殘留，后續(xù)必須去接頭。
Kmer?content：
某k個(gè)bp的短序列在reads中大量出現(xiàn)。fastqc默認(rèn)的k=5，可以通過-k --?kmers參數(shù)更改，范圍是2-10。出現(xiàn)圖一這種情況的原因要么是序列本身重復(fù)度高，比如建庫PCR的時(shí)候出現(xiàn)了Bias?；蛘遖dapter沒有除干凈。clean之后前幾個(gè)堿基還有少數(shù)高頻也沒關(guān)系，不影響后續(xù)分析，可正常使用。
以上。
可以看出我這批數(shù)據(jù)質(zhì)量還是很好的，其實(shí)可以直接比對，已經(jīng)是公司粗過濾之后的。但是我選擇了自己再過濾一遍，下一個(gè)筆記會(huì)講。
