1. Author
Screaton教授于1984年獲得劍橋大學(xué)的第一個(gè)學(xué)位，1987年搬到牛津完成醫(yī)學(xué)研究。并于1998年獲得了牛津大學(xué)的博士學(xué)位。2004年，Screaton教授被任命為帝國(guó)理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院院長(zhǎng)。2017年10月，他回到牛津大學(xué)擔(dān)任醫(yī)學(xué)科學(xué)部部長(zhǎng)。他的研究涵蓋了RNA和細(xì)胞凋亡。目前的研究方向圍繞著傳染病免疫學(xué)包括登革熱、出血熱和寨卡病毒。
David?Stuart的工作集中在病毒受體的相互作用和病毒組裝的基本難題上，同時(shí)David?Stuart正在進(jìn)行許多病毒蛋白和酶的研究——它們是潛在的藥物靶點(diǎn)和闡明病毒如何調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)。例如，天花病毒的免疫調(diào)節(jié)劑。
Juthathip主要研究是針對(duì)新出現(xiàn)病原體的免疫反應(yīng)，特別是抗體反應(yīng)，如登革熱病毒、寨卡病毒、艾滋病毒、埃博拉病毒、SARS和MERS，以及最近的新型冠狀病毒。Juthathip采用了包括病毒學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)在內(nèi)的廣泛方法來(lái)闡明致病機(jī)制，生產(chǎn)診斷和治療試劑，設(shè)計(jì)疫苗，并為政策制定做出貢獻(xiàn)。
2. Background
2.1 嵌合抗體（chimeric antibody）
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為克服鼠源性單抗的異源性反應(yīng)，人工改造鼠源性單克隆抗體成為現(xiàn)實(shí)。1984年出現(xiàn)了嵌合重組抗體技術(shù)，1994年美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)嵌合抗體藥物上市，至今嵌合抗體藥物總數(shù)已有多個(gè)，包括Abciximab，Basiliximab，Pdtmximab，Cetuximab等。
人-鼠嵌合抗體：利用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)所產(chǎn)生的單克隆抗體。人-鼠嵌合抗體的人源化程度可達(dá)到70%，完整的保留了鼠源單抗的可變區(qū)，最大限度的保留了親本活性，人抗體恒定區(qū)的引入則大大降低了免疫原性。對(duì)于其他類型的人源化抗體，其優(yōu)勢(shì)在于，技術(shù)路線簡(jiǎn)單，易于操作;抗體完整性好，在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng);鼠源抗體的親和力和特異性都得到保留，在臨床上得到了良好的反應(yīng)。
2.2 新冠變異株
新冠肺炎是SARS-CoV-2(新型冠狀病毒)引起的一種急性病毒性疾病，新型冠狀病毒主要影響呼吸系統(tǒng)，對(duì)世界人口產(chǎn)生了毀滅性影響，目前已導(dǎo)致全球380多萬(wàn)人死亡，并成為自1918年流感大流行以來(lái)最嚴(yán)重的全球健康危機(jī)。自2020年3月11日被世界衛(wèi)生組織宣布為全球大流行以來(lái)，已經(jīng)出現(xiàn)了多種重點(diǎn)關(guān)注的變種，如Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2)、Omicron（BA.4/5），該病毒繼續(xù)造成破壞，許多國(guó)家經(jīng)歷了這種病毒性肺炎的第二波或第三波爆發(fā)。SARS-CoV-2的基因組RNA全長(zhǎng)29903nt，其中開(kāi)發(fā)閱讀框ORF1a和ORF1b被翻譯，除基因組RNA外，還有9種主要的亞基因組RNA。新型冠狀病毒與SARS-CoV和MERS-CoV相似，由四種主要結(jié)構(gòu)蛋白組成:刺突蛋白(S)、包膜糖蛋白(E)、核衣殼(N)、膜(M)蛋白，以及16種非結(jié)構(gòu)蛋白和5-8種輔助蛋白。截至2021年6月22日，自大流行開(kāi)始以來(lái)，隨著多種變種的出現(xiàn)，美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心和世界衛(wèi)生組織已經(jīng)獨(dú)立地建立了一個(gè)分類系統(tǒng)，將新型冠狀病毒出現(xiàn)的變異區(qū)分為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象variants of concern (VOCs)、待觀察對(duì)象variants of interest (VOIs)和正在檢測(cè)對(duì)象variants under Monitoring(VUMs)。已發(fā)現(xiàn)五種重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象，包括Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2) 、Omicron（BA.4/5）。
Alpha
(B.1.1.7譜系):Alpha變種也稱為GRY(formerly GR/501Y.V1)，2020年12月份首次在英國(guó)通過(guò)對(duì)新冠病毒全基因組測(cè)序而報(bào)道的，其特征是包括病毒基因組中的17個(gè)突變。其中，8個(gè)突變(δ69-70缺失、δ144缺失、N501Y、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H)在刺突蛋白(S)中。N501Y顯示刺突蛋白對(duì)ACE 2受體的親和力增加，增強(qiáng)了病毒附著和隨后進(jìn)入宿主細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，它的傳播性增加了43%至82%，超過(guò)了先前存在的新型冠狀病毒變種，成為英國(guó)的主要新型冠狀病毒變種，感染B.1.1.7譜系變體的患者與先前病毒株患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比為1.64。
Beta
(B.1.351譜系):Beta變種也稱為GH501Y.V2，多重突變導(dǎo)致了2020年10月南非納爾遜·曼德拉灣的第二波新冠肺炎感染。B.1.351變種包括刺突蛋白中的九個(gè)突變(L18F、D80A、D215G、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V)，其中三個(gè)突變(K417N、E484K和N501Y)位于RBD，增加了ACE2結(jié)合親和力。據(jù)報(bào)道，這種變種通過(guò)單克隆抗體治療、恢復(fù)期血清和疫苗接種后血清傳播的風(fēng)險(xiǎn)增加，中和作用降低。
Gamma(P.1譜系):Gamma變種也被稱為GR/501Y.V3，2020年12月在巴西發(fā)現(xiàn)，B.1.1.28變種在刺突蛋白中含有10個(gè)突變(L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176、K417T、E484K和N501Y)。三個(gè)突變(L18F、K417N、E484K)位于RBD，類似于B.1.351變體。這種變體也可能降低了單克隆抗體療法、恢復(fù)期血清和疫苗接種后血清的中和作用。
Delta
(B.1.617.2 譜系):Delta最初于2020年12月在印度發(fā)現(xiàn)，是2021年4月印度致命的第二波新冠肺炎感染的主要病毒變種。Delta變種最初被認(rèn)為是一個(gè)待觀察的對(duì)象。然而，這種變種在世界范圍內(nèi)迅速傳播，促使世衛(wèi)組織在2021年5月將其歸類為重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象，B.1.617.2變異體在刺突蛋白中含有十個(gè)突變(T19R，(G142D*)、156del、157del、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N)。
Omicron（BA.4/5譜系）: BA.5最初出現(xiàn)在南非，此后不久在葡萄牙出現(xiàn)，但已在世界各地檢測(cè)到。它導(dǎo)致葡萄牙的住院人數(shù)顯著增加，并迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，現(xiàn)在在許多歐洲國(guó)家和以色列產(chǎn)生了不同程度的影響，BA.4/5變異體在刺突蛋白中含有4個(gè)獨(dú)有的位點(diǎn)（Δ69-70，L452R，F(xiàn)486V，Q493）。
3. Methods
1. 蝕斑中和試驗(yàn)（FRNT）
2. ACE2和RBD蛋白的表達(dá)純化
3. 生物層干涉測(cè)量（BLI）
4. 抗體的表達(dá)純化
5. X射線晶體衍射
蝕斑中和試驗(yàn)（FRNT）
·? 細(xì)胞接種：每孔按1 x 106細(xì)胞每毫升培養(yǎng)基接種細(xì)胞至6-孔板里。輕輕地前后左右搖晃培養(yǎng)板使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確認(rèn)細(xì)胞是否分布均勻并達(dá)到80%以上的融合度。
·? 制備瓊脂糖：用水配制2%的瓊脂糖，高壓滅菌并使之溶化，然后將瓊脂糖置于42°C水浴中使之保持在熔解狀態(tài)。將細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)熱至37°C。（1h后確認(rèn)瓊脂糖溫度是否處于42°C，觀察其是否仍處于溶解狀態(tài)但又不至于燙手）。
·? 準(zhǔn)備病毒梯度稀釋液：標(biāo)記6個(gè)無(wú)菌離心管，用于制備病毒稀釋液。在第1管內(nèi)加入990μl，剩下5管分別加入900μl細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。按以下方法進(jìn)行梯度稀釋：在第1管中加入10μl病毒原液（稀釋度1:100）充分混勻，然后從第1管吸100μl加入第2管，依次類推，進(jìn)行10倍梯度稀釋。管2至管6的稀釋度分別為 10-3 到 10-7。
·? 感染細(xì)胞單層：用無(wú)菌吸管吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μl上述稀釋好的10-3 到 10-7 的病毒液，留一個(gè)孔不加作為空白對(duì)照。每板按同樣的方法操作。室溫放置1h讓病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。
·? 覆蓋瓊脂糖：1h后，小心吸去病毒液，避免碰到細(xì)胞。將2%的瓊脂糖和預(yù)熱的培養(yǎng)基按1:1的比例混勻后加輕輕地加1.5mL至每孔細(xì)胞上，室溫靜置20min使其冷卻凝固成覆蓋層。將培養(yǎng)板置室溫或 27°C 培養(yǎng) 6-10 日。
·? 空斑觀察和計(jì)數(shù)：用光從45度角照射培養(yǎng)板，或者可以將培養(yǎng)板倒置在一個(gè)黑色背景上，計(jì)數(shù)空斑數(shù)量。為了更易于觀察，也可以每孔加入1mL 0.03%的中性紅（用水或PBS稀釋），室溫或27°C 孵育2-3h，未被病毒感染的細(xì)胞會(huì)被中性紅染上而中間未被著色的小區(qū)域即為空斑（直徑約為0.5-3mm）。計(jì)數(shù)每孔的空斑數(shù)量并按以下方法計(jì)算病毒滴度：病毒滴度（pfu/ml）=空斑數(shù)×(1 ml / 0.1 ml)/稀釋倍數(shù)。
?4. Results
P.1最早于2020年12月出現(xiàn)在巴西北部亞馬遜省的瑪瑙斯。隨后迅速造成了全世界的大面積感染。P1相比于原始毒株，在個(gè)亞基上都有著突變：NTD—L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S；RBD—K417T, E484K, N501Y；CTD—D614G,H655Y；S2—T1027I,V1176F。其中，因?yàn)?b>K417T, E484K, N501Y的突變可以幫助新冠病毒逃逸大部分抗體，所以廣受關(guān)注。在出現(xiàn)的諸多變異株中，他們?cè)贜TD的結(jié)構(gòu)域中或多或少的存在著一些刪除突變，比如：B1.1.7的Δ69–70和Δ144；B1.351的Δ242-244；P.1雖然沒(méi)有刪除突變，但是T20N,R190S是兩個(gè)值得被關(guān)注的位點(diǎn)。
N501Y的突變可以是使RBD和ACE2的親和力陡然上升7倍，當(dāng)N501Y,K417,E484K同時(shí)發(fā)生時(shí)，親和力會(huì)提升19倍。通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段對(duì)二者的結(jié)合進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)：①417位點(diǎn)位于RBD“頸”的背面，突變前的賴氨酸和ACE2的D30形成鹽橋；②484位點(diǎn)位于RBD”左肩”上，由Glu變成了Lys可以促進(jìn)靜電互補(bǔ)作用進(jìn)而增大親和力；③501位點(diǎn)位于RBD“右肩”上，通過(guò)堆積力，增大了親和力。
面對(duì)如此強(qiáng)大的變異株，許多抗體的中和能力都收到了影響，比如①RBD抗體：禮萊的兩個(gè)抗體（LY-CoV16和LY-CoV555），再生元的REGN10933和阿斯利康的AZD8895或多或少對(duì)γ和β變異株失去了中和能力。但是AZD1061，AZDA744并沒(méi)有喪失中和能力。其中IGHV3-53的抗體LY-CoV16的中和能力喪失可能是因?yàn)镵417，N501Y位點(diǎn)的突變，LY-CoV555可能是因?yàn)镋484K導(dǎo)致的。②NTD抗體：mAb159銳減了133倍。③IGHV3-53：150,158, 175, 222, 和 269。通過(guò)解析150 158 269的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)CDR-H3的 K417和CDR-L1的N501位點(diǎn)是抗體結(jié)合的重要位點(diǎn)，所以當(dāng)這兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變以后，親和力會(huì)陡然下降。但在這些抗體中222幾乎不受突變體的影響，仍然可以起到中和的作用。
進(jìn)一步通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段去理解“為什么222這個(gè)抗體并沒(méi)有受到突變體的影響?！保婚_(kāi)始，417號(hào)位的Lys與抗體CDR99號(hào)位殘基以微弱的鹽橋鍵連接，而突變后仍然存在橋鍵作用。501號(hào)位突變?cè)黾恿伺c抗體pro的堆疊作用。綜上所述，222受突變體的影響最小。
正是因?yàn)閙Ab 222輕鏈可變區(qū)的特殊結(jié)構(gòu)使得他能夠?qū)ν蛔凅w仍有中和作用。所以作者想通過(guò)組裝222的輕鏈可變區(qū)與其他3-53家族重鏈可變區(qū)，觀察是否能夠免疫變異株的逃逸。令人驚訝的是只要是222LC的嵌合抗體，都可以對(duì)突變株起到一定的中作用。
5. Discussion
實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)從巴西一名感染患者的咽拭子中培養(yǎng)出的P.1（γ）分離株，并將其與其他三種病毒進(jìn)行了比較:一種早期分離株B.1.1.7（α）和B.1.351（β）。后續(xù)測(cè)試了接種疫苗所誘導(dǎo)的免疫血清對(duì)P.1進(jìn)行中和的能力，發(fā)現(xiàn)：免疫血清對(duì)P.1，B.1.1.7的中和能力下降，B.1.351下降最為嚴(yán)重。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)P.1 RBD對(duì)ACE2的親和力增加，并通過(guò)晶體學(xué)研究了其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)還通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)，研究了強(qiáng)效抗體mAb 222用來(lái)阻斷RBD-ACE2相互作用?？贵wmAb 222可以同時(shí)接觸K417和N501的，從而對(duì)P.1/B1.351菌株產(chǎn)生抗性。在此基礎(chǔ)上通過(guò)交換輕鏈來(lái)恢復(fù)某些抗體的中和作用。最后，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)收集了P.1（γ）、B.1.351（β）和B.1.1.7（α）的數(shù)據(jù)，并試圖解釋這些對(duì)早期SARS-CoV-2毒株產(chǎn)生的血清中和能力的不同影響。
