? ? ? ?剛接觸磁珠（beads）純化時(shí)，覺(jué)得磁珠這東西好神奇，竟然能回收不同長(zhǎng)度的DNA。其實(shí)磁珠只是能吸附大于某個(gè)長(zhǎng)度的DNA，如果要篩選特定大小范圍的DNA，需要做兩步磁珠純化，先用較稀的磁珠吸附走過(guò)大的片段，然后用較濃的磁珠篩選掉過(guò)小的片段，剩下就是想要的大小范圍的DNA。
一、磁珠吸附DNA和片段篩選原理
? ? ? ?一般磁珠由三層構(gòu)成，最里面是聚苯乙烯，外面包裹一層磁性物質(zhì)四氧化三鐵，最外面再包一層高分子材料，上面偶聯(lián)不同的官能團(tuán)。不同功能的磁珠，偶聯(lián)的官能團(tuán)不同，純化核酸用的一般是羧基（-COOH）。
? ? ? ?磁珠純化DNA/RNA核心技術(shù)是固相可逆固定化技術(shù)（Solid-phase reversible immobilization，SPRI），但磁珠和DNA具體是如果相互作用吸附在一起，目前還不是很清楚，鹽橋理論是其中猜想之一。在較高濃度的PEG和NaCl溶液中，PEG奪取DNA分子外面水化層的水，導(dǎo)致水化層被破壞，DNA分子發(fā)生聚集沉淀，帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)裸露出來(lái)，通過(guò)鈉離子與磁珠表面的羧基形成“鹽橋”，或者也叫“電橋”，使得DNA吸附到磁珠表面。
? ? ? ?DNA越長(zhǎng)，表面裸露出來(lái)帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)越多，整條分子帶的負(fù)電就更強(qiáng)，更容易吸附到磁珠，只需要較低濃度的PEG和NaCl，就可以回收；DNA越短，就需要更高濃度的PEG和NaCl，將其表面的水化層破壞得更徹底，裸露出來(lái)足夠多帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)，才能被磁珠吸附住，從而回收回來(lái)。所以如果想回收較短的DNA片段時(shí)，需要加入的磁珠體積更大。
? ? ? ?此外，體系中的PEG還可以增加溶液的粘稠度，讓磁珠保持懸浮不容易沉聚，在DNA binding過(guò)程中更充分與DNA接觸，同時(shí)PEG也不易造成蛋白變性和非特異性吸附。但是PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、溫度等的影響，溫度過(guò)低PEG也不易與水完全互溶，所以磁珠一般都要求室溫平衡后再用，其儲(chǔ)存buffer里也會(huì)加一些低濃度的pH穩(wěn)定劑，如Tris-HCl等。
二、酒精清洗鹽離子
? ? ? ?DNA吸附上磁珠之后，會(huì)用75—85%的酒精去清洗體系中殘留的鹽，鹽被洗掉了，鹽橋被破壞，DNA不就從磁珠上掉下來(lái)了嗎？其實(shí)不是這樣的，第一，DNA在這個(gè)濃度的酒精里溶解度很低；第二，DNA這個(gè)時(shí)候是聚集狀態(tài)，磁珠剛好提供一個(gè)聚集的奇點(diǎn)，讓DNA沉聚在其周圍，所以絕大部分DNA不會(huì)掉下來(lái)。但酒精濃度很重要，一般都要求新鮮配制，濃度太低，體系中過(guò)多的水會(huì)將部分DNA從磁珠上溶解下來(lái)，造成DNA損失。具體使用多少濃度的酒精視情況而定，濃度越高，體系中水越少，清洗鹽離子的能力減弱，但DNA的溶解度小，回收率高；酒精濃度越低，鹽離子可以清洗得更干凈，但DNA的回收率可能會(huì)收到影響。如果DNA片段較?。ㄐ∮?00bp），清洗推薦使用較高濃度的酒精，減少清洗時(shí)的損失，甚至可以在結(jié)合磁珠的時(shí)候就加入一定量的酒精，輔助DNA沉淀，以提高回收率。
三、洗脫DNA
? ? ? ?酒精清理后，先需要晾干磁珠上殘留的酒精，以防影響下游實(shí)驗(yàn)。晾干后加入水或者TE buffer，這時(shí)體系中已經(jīng)沒(méi)有鈉離子和PEG，無(wú)法形成電橋結(jié)構(gòu)，帶負(fù)電的DNA和磁珠之間相排斥，水重新包裹DNA形成水化層，使其從磁珠上洗脫下來(lái)，溶解到溶液中。注意晾干時(shí)磁珠表面無(wú)光澤即可，過(guò)度干燥，體系失水過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致磁珠DNA進(jìn)一步聚集，最終DNA很難回溶到水中，影響回收率。
四、磁珠和柱子
? ? ? ?柱子回收DNA原理和磁珠差不多，不同的是大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜，實(shí)際上就是一層玻璃纖維，其表面有大量修飾的硅羥基（Si-OH），硅羥基在溶液中解離后也帶負(fù)電，然后與帶正電鹽離子、帶負(fù)電DNA形成電橋，從而吸附住DNA。目前除了少數(shù)磁珠表面也還是采用硅羥基，主流磁珠，比如Ampure XP beads，基本上都換成產(chǎn)量更高，非特異性結(jié)合更少的羧基化磁珠。
五、磁珠與RNA
? ? ? 不管雙鏈DNA、單鏈DNA，還是RNA，都可以在溶液中解離出帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)，因此都可以用磁珠進(jìn)行純化回收，但單鏈DNA和RNA都沒(méi)辦法進(jìn)行片段大小篩選。雙鏈DNA的二級(jí)結(jié)果一般是一條較穩(wěn)定的線性雙螺旋分子，在PEG的存在下，解離出來(lái)帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)多少和其長(zhǎng)度正相關(guān)，而RNA和單鏈DNA，二級(jí)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，導(dǎo)致其裸露出來(lái)的負(fù)電基團(tuán)無(wú)法跟長(zhǎng)度呈正相關(guān)，所以沒(méi)辦法像DNA那樣進(jìn)行片段篩選。
? ? ? ?另外RNA和DNA在不同pH下穩(wěn)定性不一樣，所以純化RNA的磁珠buffer中pH和純化DNA的磁珠是不一樣的。
資料參考：
John T.? Lis，Robert Schleif. Size fractionstion of double stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acid Research(1975)
L. S. Lerman. A transition to a compact form of DNA in polymer solution. PNAS(1971)
Spin column based nucleic acid purification, https://en.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification
