miRNA+囊泡套路
知識
miRNA 的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的加工成熟，位于供體細(xì)胞 miRNA 由一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體加工而來
miRNA 與結(jié)合靶基因 mRNA（發(fā)揮生物學(xué)功能），發(fā)生在受體細(xì)胞
miRNA 的經(jīng)典作用機(jī)制是結(jié)合下游的靶基因的 mRNA 并抑制 mRNA 的翻譯表達(dá)
細(xì)胞交互+miRNA
數(shù)據(jù)上有擴(kuò)充：
1. 供體細(xì)胞里面 miRNA 的表達(dá)、分泌的情況
2. 包裹在囊泡中的 miRNA 是否被受體細(xì)胞接收
3. 受體細(xì)胞中 miRNA 結(jié)合靶基因的表型 這個(gè)工作量相當(dāng)于是兩套 miRNA 靶基因數(shù)據(jù)集合到一篇文章
☆實(shí)操步驟
上一策叫半壁江山半套
這一策可以看成兩個(gè)半套合成完整一套，可以分成上下兩部分?jǐn)?shù)據(jù)
上半部（揭示現(xiàn)象、闡釋機(jī)制）
供體細(xì)胞中主變量 miRNA 的表達(dá)變化
細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的囊泡數(shù)量以及內(nèi)含的 miRNA 數(shù)量
下半部
受體細(xì)胞接受囊泡中的 miRNA
明確 miRNA 來自外源導(dǎo)入，并非是受體細(xì)胞內(nèi)合成的增加
在此基礎(chǔ)上解釋清楚主變量 miRNA 的功能以及它下游的靶基因機(jī)制
建立 miRNA 跟疾病相關(guān)表型的聯(lián)系
具體10步
第一步 確認(rèn)細(xì)胞相互交互：用供體細(xì)胞的培養(yǎng)上清處理受體細(xì)胞，觀察受體細(xì)胞表型變化 相當(dāng)于加藥，用法和標(biāo)評價(jià)表型是否變化 這步相當(dāng)于預(yù)實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞交互的課題的前提就是存在交互，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)研究
交互分為：
- 直接接觸（不推薦）
2.通過分泌分子或囊泡運(yùn)輸（更有延展性）√
第二步：表達(dá)差異
細(xì)胞上清樣品抽提外泌體送 miRNA 芯片測序，找差異的 candidates list （ 27 策）
在細(xì)胞交互課題中，表達(dá)差異放在第二步。原因： 1、該課題前體是有交互，否則立論不成立 2、供體細(xì)胞上清加到受體細(xì)胞，非常簡單，不涉及基因操作
第三步，鎖定外泌體中差異表達(dá)的 miRNA 分子，操作分子(正反回復(fù))看表型，驗(yàn)證功能
1）怎么操作？
√在供體細(xì)胞過表達(dá)或者沉默 miRNA，然后同樣再用細(xì)胞上清去孵育受體細(xì) 胞，與對照組沒有操作分子的培養(yǎng)上清進(jìn)行比較，看表型是不是被阻斷
X 錯(cuò)誤的做法：在外泌體上操作主變量，把 miRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)外泌體這是沒法弄的
2）一正或一反，只做阻斷 loss of function 就可以
問：為什么這一步不正反回復(fù)做全？
我們通常傾向于研究高表達(dá)的分子，所以這步一般沉默 miRNA 且細(xì)胞交互課題數(shù)據(jù)量龐大，第三步才剛開始，后面還有重要數(shù)據(jù)
兩種方法：
1 沉默 miRNA
2 用商業(yè)化抑制劑阻斷外泌體合成必要的酶，或封閉或沉默參與外泌體釋放的關(guān) 鍵蛋白(相當(dāng)于拆運(yùn)輸載體)
第四步，從供體細(xì)胞的上清提取、分離并鑒定外泌體（鑒定囊泡）
分離試劑盒：有專門的商業(yè)化試劑盒
分離原理：離心、色譜、過濾、基于高分子聚合物的沉淀、免疫親和分離
鑒定：
?透射電鏡，觀察外泌體形態(tài)
? 動態(tài)光散射 DLS，分析顆粒粒徑大小，顆粒密度
? ZETA 電位，檢測顆粒電荷
? Western、免疫熒光檢測外泌體 marker（組織細(xì)胞蛋白）
常見的有熱休克蛋白 HSP70，TSG101，cd63，需查文獻(xiàn)整理
? ELISA 檢測體液中的分泌蛋白
注意：western 和 ELISA 都是檢測蛋白，但檢測的對象不同，前者為體液 中的分泌蛋白，后者為組織細(xì)胞蛋白 qPCR、芯片、測序監(jiān)測非編碼 RNA
△第五步，用親脂性的熒光染料（DII、DID、DIO、DIR）標(biāo)記示蹤外泌體，觀察受體細(xì)胞的 對外泌體的攝入情況
熒光染料是一些差不多的衍生化合物 熒光染料進(jìn)入細(xì)胞膜前，熒光很多，結(jié)合細(xì)胞膜后，熒光強(qiáng)度大大增加 熒光進(jìn)入細(xì)胞后，使細(xì)胞顯色 這步屬于鑒定囊泡的特殊步驟，屬于細(xì)胞交互的特殊配置 如果是 circulating 分子，不經(jīng)由囊泡，可以直接標(biāo)記分子觀察攝入的情況
第六步，觀察受體細(xì)胞中的主變量表達(dá)變化和表型變化
（邏輯：主變量→表型，單變量表型 論證），但是操作環(huán)節(jié)在供體細(xì)胞
第七步：動物表型驗(yàn)證（非必須）
預(yù)防性策略：先分子操作，再打動物
治療性策略：先制作模型，再直接打分子操作工具
細(xì)胞交互課題中，兩種策略： 動物水平直接操作分子，改變分子表達(dá)產(chǎn)生表型 在供體細(xì)胞上操作分子，用供體細(xì)胞的培養(yǎng)上清或上清的提取物注射動物 條件更苛刻：不僅需要分子操作，還必須是分泌的才有作用 具真正意義 注意：這一步非必須，通常第六步后是探討分子機(jī)制，建立多元變量調(diào)控關(guān)系
第八步，先下后上，探索受體細(xì)胞 miRNA 靶基因的直接作用機(jī)制，或分子加通路的間接機(jī)制
MiRNA 靶基因直接機(jī)制，同 11 策 Mimics miRNA→靶基因↓ Inhibitor miRNA →靶基因↑ 操作 miRNA+操作靶基因（反正正，反反反）→ 表型回復(fù) ！
不同點(diǎn)：操作主變量或阻斷外泌體永遠(yuǎn)在供體細(xì)胞，rescue 操作靶基因或下游 通路在受體細(xì)胞
第九步，上游機(jī)制，也有直接和間接
解釋主變量釋放增加的原因：本身表達(dá)增加？還是細(xì) 胞分泌增加？
1 MiRNA 可以在基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后三個(gè)水平來探討
2 其他的分子類型可以從基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后五個(gè)水平挖掘機(jī)制
3 另外，circulating 的分子可以從是直接分泌還是囊泡運(yùn)輸來分泌進(jìn)行探索 就像分子修飾找上游的酶 因?yàn)榉肿拥姆秶淮螅怯邢薹肿拥慕Y(jié)合 以上的路不一定都能走通，走通一條就可以 ！注意：研究外泌體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程中，有特異性和非特異性兩種作用方式
非特異性是指受體細(xì)胞，它什么外泌體都吞，不挑食，來了就吃 特異性作用指外泌體表面有膜蛋白
? 外泌體表面是一個(gè)雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，跟細(xì)胞膜一樣，有膜蛋白（內(nèi)容物也有蛋白）
? 這個(gè)膜蛋白也可以結(jié)合受體細(xì)胞膜表面的受體，通過配體受體的結(jié)合來增加識 別的特異性，這就把問題進(jìn)一步復(fù)雜化了
? 如果一篇文章它既沒有做供體細(xì)胞主變量為什么表達(dá)上升，也沒有做外泌體的 合成和分泌變化，卻探討了外泌體識別受體的膜蛋白，也是上游機(jī)制
第十步，跨空間 rescue
細(xì)胞交互是一個(gè)多步驟的過程 當(dāng)分子經(jīng)由囊泡分泌，阻斷囊泡合成、分泌以及靶細(xì)胞對囊泡的識別和攝入都可以 設(shè)計(jì) rescue。
這個(gè)設(shè)計(jì)目的主要說明該信號傳遞依賴于囊泡，是必要性論證
外泌體+miRNA 套路之所以看起來復(fù)雜，因?yàn)橛卸嗵幉僮骺梢苑至?比如操作主變量這步，如果操作外泌體，效果相同 還兼容直接機(jī)制的數(shù)據(jù)，
如 MiRNA+靶基因就是最簡單的直接機(jī)制 其他更復(fù)雜的蛋白蛋白交互、蛋白 RNA 交互加外泌體的注意事項(xiàng)在下次課降解
！注意：多變量 rescue 設(shè)計(jì)容易出錯(cuò) 要點(diǎn)：圍繞主變量進(jìn)行設(shè)計(jì) 細(xì)胞交互課題新增一條邏輯證明：變量間的調(diào)控關(guān)系依賴于細(xì)胞交互 因變量與因變量之間的 rescue 設(shè)計(jì)往往可以省略
