讀懂FastQC報告 Part I
通過前面的5個問題，我相信大家對Illumina測序，測序的儲存文件格式，一些簡單的建庫原理已經(jīng)有了一個初步的認識。那么接下來，我們就要用我們學(xué)到的知識去解決一些問題啦。
在實際操作和處理過程中，我們拿到的Illumina測序數(shù)據(jù)應(yīng)該是.fastq.gz格式，其中g(shù)z表示的是使用gzip進行壓縮，fastq表示使用fastq格式進行存儲。獲得數(shù)據(jù)的第一步，通常就是使用FastQC軟件進行質(zhì)控。
FastQC會對每一個輸入的fastq.gz文件生成1個html網(wǎng)頁和一個zip的壓縮包。壓縮包里是網(wǎng)頁中包含的圖片信息，因此我們只需要看網(wǎng)頁里面整理好的內(nèi)容就好。
今天的問題圍繞著FastQC的質(zhì)控圖來展開，請看下面2張圖。
圖1 - 1個Illumina測序結(jié)果， reads1 的 per-base quality boxplot
圖2 - 1個Illumina測序結(jié)果， reads2 的 per-base quality boxplot
問題如下：
1. 圖中的橫坐標表示什么意思？
橫軸是測序序列的第1個堿基到第150個堿基
2. 圖中的縱坐標表示什么意思？
- 縱坐標越小錯誤概率越大；
- 縱坐標表示每一個bp所對應(yīng)的測序質(zhì)量值Q，
- 這個數(shù)值Q是這樣計算的：Q = -10*log10(error P);
- 將該堿基判斷錯誤概率值P取log10之后再乘以-10,得到的結(jié)果再加上Phred值對應(yīng)ASCII表所得到的的值就是該堿基測序的質(zhì)量值;
- 即20表示1%的錯誤率，30表示0.1%的錯誤率;
3. 圖中的藍色線是什么意思？
藍色的細線是各個位置的質(zhì)量值的平均值的連線
4. 圖中的box 下面的bar ， 上面的bar，箱體的下沿，箱體的上沿，箱體內(nèi)部的橫線分別代表什么意思？
每一個boxplot，都是該位置的所有序列的測序質(zhì)量的一個統(tǒng)計，
上面的bar是90%分位數(shù)，
下面的bar是10%分位數(shù)，
箱子的中間的橫線是50%分位數(shù)，
箱體的上緣是75%分位數(shù)，
箱體的下緣是25%分位數(shù)
什么是分位數(shù)：如果一組數(shù)的25%分位數(shù)是a，意味著a超過了這組數(shù)中25%數(shù)字的大小
5. 圖1與圖2最主要的區(qū)別在哪里？結(jié)合我們之前的問題，為什么會出現(xiàn)這種情況？
相比于reads 1的測序結(jié)果，reads 2的測序質(zhì)量均勻性差，準確率低，
主要原因：
- reads 2的測序是在reads 1150bp 測序完成以后
- forward strands 再通過1次橋式PCR合成reverse strands
- 這之后再進行熒光測序
- 測序質(zhì)量差的主要原因是因為長時間測序結(jié)束以后，合成酶的活性降低，導(dǎo)致合成時加不上一些堿基，最終同步性變差，主要是phasing錯誤。
