clust 是一種用于識(shí)別在一個(gè)或多個(gè)物種的異構(gòu)數(shù)據(jù)集中持續(xù)共表達(dá)（相關(guān)性良好）的基因簇（組）的全自動(dòng)方法。

Workflow_PyPkg.png

（一）對(duì)于單個(gè)數(shù)據(jù)集，clust 自動(dòng)識(shí)別共表達(dá)基因的 clusters 的數(shù)量 k 并完成聚類。

Clusters_1DS.png

（二）對(duì)于多個(gè)數(shù)據(jù)集，clust 自動(dòng)識(shí)別在每個(gè)輸入數(shù)據(jù)集中共表達(dá)（相關(guān)性良好）的基因 clusters，此處每個(gè)數(shù)據(jù)集的條件或時(shí)間點(diǎn)數(shù)量不同。

Clusters.png

對(duì)于 clust，具有如下的特征：

• 無(wú)需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，clust 能夠自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理
• 無(wú)需預(yù)設(shè)聚類的數(shù)量，clust 能夠自動(dòng)識(shí)別 cluster 的數(shù)目
• 可以通過(guò)參數(shù) -t 控制聚類的緊密度（tightness）
• 同時(shí)也可以適用于如下數(shù)據(jù)集：
  • 由不同技術(shù)生成（如 RNA-seq 或微陣列）
  • 來(lái)自不同物種
  • 條件或時(shí)間點(diǎn)數(shù)量不同
  • 同一條件有多個(gè)重復(fù)
  • 需要不同類型的歸一化
  • 由不同年份和實(shí)驗(yàn)室生成
  • 存在缺失值
  • 并非所有基因都被包含在每個(gè)數(shù)據(jù)集中
• 輸出文件：
  • 聚類統(tǒng)計(jì)表
  • 列出各聚類所含基因的表格
  • 預(yù)處理（歸一化、匯總和過(guò)濾）數(shù)據(jù)集文件
  • 聚類基因表達(dá)譜圖譜（PDF 文件）

官網(wǎng)：https://github.com/BaselAbujamous/clust

網(wǎng)頁(yè)版：http://clust.baselabujamous.com

安裝

方法一：使用 conda（推薦）

conda create -n clust
conda activate clust
conda install -c bioconda clust

方法二：使用 pip

# 以下任選一條命令即可
sudo pip install clust
pip install --user clust

補(bǔ)充：更新版本（分別對(duì)應(yīng)如上的安裝命令）

conda update -c bioconda clust
sudo pip install clust --upgrade
pip install --user clust --upgrade

使用

1. 基礎(chǔ)版

輸入數(shù)據(jù)格式：每個(gè)數(shù)據(jù)集都以單個(gè) TAB 分隔（TSV）文件表示，其中第一列表示基因 ID，第一行表示樣本的唯一標(biāo)簽，文件的其余部分包括數(shù)值，主要是基因表達(dá)值。

Data_simple.png

注意：當(dāng)相同的基因 ID 出現(xiàn)在不同的數(shù)據(jù)集中時(shí)，會(huì)被認(rèn)為是同一個(gè)基因；如果同一文件中有多行具有相同的標(biāo)識(shí)符會(huì)自動(dòng)將它們的值相加進(jìn)行匯總；基因名稱不應(yīng)包含空格、逗號(hào)或分號(hào)。

（一）對(duì)于歸一化過(guò)的同質(zhì)數(shù)據(jù)集，可以直接運(yùn)行：

clust data_path -o output_directory [...]

該命令使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行 clust，data_path 可以是單個(gè)數(shù)據(jù)文件（v1.8.5 以上）的路徑，也可以是包含一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)文件的目錄路徑；如果沒(méi)使用 -o 提供輸出目錄，clust 會(huì)在當(dāng)前工作目錄下為結(jié)果創(chuàng)建一個(gè)新目錄。

（二）對(duì)于原始 RNA-seq TPM、FPKM 或 RPKM 數(shù)據(jù)，可參考如下進(jìn)階版的歸一化部分。 有關(guān)處理 replicates 數(shù)據(jù)、處理來(lái)自多個(gè)物種的數(shù)據(jù)，以及處理微陣列數(shù)據(jù)（僅RNA-seq數(shù)據(jù)或與RNA-seq數(shù)據(jù)混合）也可參考如下進(jìn)階版中對(duì)應(yīng)內(nèi)容。

2. 進(jìn)階版

2.1 歸一化（Normalisation）

在 V1.7.0 及更新版本中，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)規(guī)范化，除非用戶通過(guò) -n 另有說(shuō)明，否則會(huì)自動(dòng)檢測(cè)每個(gè)數(shù)據(jù)集最適合的歸一化方法，所使用的歸一化 codes 存儲(chǔ)在輸出文件 /Normalisation_actual 中。

$ cat ~/clust/rpkm_Results_05_Aug_24/Normalisation_actual.txt
total_rpkm_gene.csv     101 3 4

在 V1.6.0 及更早版本 中，用戶應(yīng)通過(guò) -n 說(shuō)明所需的歸一化技術(shù)，否則不應(yīng)用歸一化。

（一）方法一（V1.7.0 及更新版本）：列出要應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)集的一個(gè)或多個(gè)歸一化 codes（可從下表中選?。?/p>

clust data_path -n code1 [code2 code3 ...] [...]

# 示例
clust total_rpkm_gene.csv -n 101 3 4 -o rpkm_Results_05_Aug_24

（二）方法二：提供列出每個(gè)數(shù)據(jù)集的歸一化 codes 的文件，分隔符可以是空格、TAB、逗號(hào)或分號(hào)

NormalisationFile.png

clust data_path -n normalisation_file [...]

# 示例
clust total_rpkm_gene.csv -n Normalisation_actual.txt -o rpkm_Results_05_Aug_24

常用數(shù)據(jù)集建議 codes：

• RNA-seq TPM, FPKM, and RPKM data: 101 3 4
• Log2 RNA-seq TPM, FPKM, and RPKM data: 101 4
• One-colour microarray gene expression data: 101 3 4
• Log2 one-colour microarray gene expression data: 101 4
• Two-colour microarray gene expression data: 3 6
• Log2 two-colour microarray gene expression data: 6
• Log2 fold-changes 4

在此基礎(chǔ)上，如果數(shù)據(jù)集中有太多的零或一些負(fù)值，則建議使用 31 代替 3。

All normalisation codes：

注意：codes 的順序決定了歸一化技術(shù)的應(yīng)用順序

2.2 處理 replicates

提供包含有 replicates 信息的文件，其中文件中的每一行代表一個(gè)樣本，按順序包含數(shù)據(jù)集文件的名稱（如 X0.txt），樣本條件的名稱，該樣本條件的一個(gè)或多個(gè) replicates 名稱，且這些名稱應(yīng)與數(shù)據(jù)集文件中的列名相匹配，分隔符可以是空格、TAB、逗號(hào)或分號(hào)。

ReplicatesFile.png

$ cat rpkm_replicates_file.txt
total_rpkm_gene.csv AC   AC1_count, AC2_count, AC3_count
total_rpkm_gene.csv BC   BC1_count, BC2_count, BC3_count
total_rpkm_gene.csv BD   BD1_count, BD2_count, BD3_count
total_rpkm_gene.csv AD   AD1_count, AD2_count, AD3_count
total_rpkm_gene.csv BE   BE1_count, BE2_count, BE3_count
total_rpkm_gene.csv AE   AE1_count, AE2_count, AE3_count

具體使用代碼：

clust data_path -r replicates_file [...]

# 示例
clust total_rpkm_gene.csv -r rpkm_replicates_file.txt -o rpkm_Results_05_Aug_24

2.3 多物種數(shù)據(jù)

提供包含有多物種信息的文件 mapping file，其中 mapping file 是一個(gè) TAB 分隔文件，第一行顯示物種名稱，第一列顯示 orthologue groups（OG）的 ID，每個(gè) OG 包括零個(gè)、一個(gè)或多個(gè)orthologous genes，每個(gè)物種一欄用逗號(hào)分隔，具體文件格式可參考官網(wǎng)信息。

clust data_path -m map_file [...]

2.4 多技術(shù)數(shù)據(jù)

提供包含有多技術(shù)信息的文件mapping file，注意此處需要為不同技術(shù)數(shù)據(jù)集應(yīng)用不同的歸一化 codes，如果微陣列數(shù)據(jù)文件的第一列包含探針 ID，而這些探針 ID 在使用不同微陣列/RNA-seq 平臺(tái)生成的數(shù)據(jù)集中并不完全相同，則應(yīng)確保探針-基因映射信息包含在上述 mapping file 中，具體文件格式可參考官網(wǎng)信息。

clust data_path -m map_file [...]

2.5 缺失值處理

使用 -d 自動(dòng)舍棄未出現(xiàn)在所有（或大部分）數(shù)據(jù)集中的基因；如共有 20 個(gè)數(shù)據(jù)集，可以通過(guò)以下方法強(qiáng)制 clust 丟棄至少 17 個(gè)數(shù)據(jù)集未包含的基因：

clust data_path -d 17 [...]

2.6 低表達(dá)基因處理

在 v1.7.0+ 中，clust 默認(rèn)會(huì)在合并 replicates 和歸一化后過(guò)濾掉表達(dá)譜平坦（表達(dá)譜完全沒(méi)有變化）的基因；可使用 --no-fil-flat 禁止該操作。

如果向 clust 提供三個(gè)選項(xiàng) -fil-v、-fil-c 和 -fil-d，clust 可以自動(dòng)過(guò)濾掉表達(dá)值低的基因：

clust data_path -fil-v value -fil-c conditions -fil-d datasets

此代碼將舍棄在數(shù)據(jù)集中低于 value 值、在 conditions 條件下低于 conditions 值的所有基因。

此部分需要在歸一化之前使用，但要在合并 replicates 數(shù)據(jù)和處理跨物種基因 mapping 之后使用。

2.7 noisy clusters 處理

緊密度參數(shù) -t 可以控制聚類的緊密程度（較緊密較小的聚類 vs 較不緊密較大的聚類），為正實(shí)數(shù)，默認(rèn)值為 1.0；小于 1.0 的值（如 0.5）產(chǎn)生的聚類不太緊密，而大于 1.0 的值（如 2.0、5.0、10.0...）產(chǎn)生的聚類更緊密。

更大的 -t 值可以獲得更緊密的聚類：

clust data_path -t tightness_level

示例

clust Data/ -r Replicates.txt \
    -n Normalisation.txt \
    -m MapIDs.txt \
    -t 5 \
    -o MyResultsDirectory/

參考

1. BaselAbujamous/clust: Automatic and optimised consensus clustering of one or more heterogeneous datasets (github.com)
2. Basel Abu-Jamous and Steven Kelly (2018) Clust: automatic extraction of optimal coexpressed gene clusters from gene expression data. Genome Biology: 19:172; doi: https://doi.org/10.1186/s13059-018-1536-8.