做生物基礎(chǔ)科研研究的同學(xué)肯定都聽過CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的大名，你對(duì)這獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷的系統(tǒng)了解多少呢？ 快來隨我一起學(xué)習(xí)一下吧

小郭叨叨叨：
最近將要開始使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)結(jié)合lentivirus系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，訂購(gòu)質(zhì)粒時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)某些概念及細(xì)節(jié)不甚清楚，搜尋度娘，發(fā)現(xiàn)度娘也愁眉苦臉，遂決定較為系統(tǒng)地學(xué)習(xí)一下此方面的知識(shí)。特此翻譯整理相關(guān)內(nèi)容。
本部分內(nèi)容主要翻譯于abm公司網(wǎng)站，感興趣的同學(xué)請(qǐng)移步觀看原文An Intro to CRISPR Cas9

CRISPR Cas9 -- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9

細(xì)菌免疫系統(tǒng)

Crispr-CAS9系統(tǒng)最初在細(xì)菌和古生菌中觀察到，作為一種適應(yīng)性微生物免疫系統(tǒng)，提供對(duì)外來病毒和質(zhì)粒的獲得性免疫；已測(cè)序物種中，40%的細(xì)菌和90%的古生菌可觀察到CRISPR基因座，且細(xì)菌中可能存在一個(gè)以上的基因座。

入侵的外來DNA被Cas核酸酶切割，然后以間隔序列的形式被保守的重復(fù)序列捕獲并整合到crispr位點(diǎn)，所獲得的間隔物作為創(chuàng)建短CRISPR RNA（crRNAs；create short CRISPR RNAs ）的模板，它與反式激活cRNA（tracRNA；trans-activating crRNA ）形成復(fù)合物；它們一起起到引導(dǎo)鏈的作用，將cas9核酸酶導(dǎo)向互補(bǔ)的入侵DNA（3）。一旦結(jié)合，cas9蛋白通過其HNH和RuvC-like核酸酶結(jié)構(gòu)域分別切割“crRNA互補(bǔ)”及反義鏈。

CRISPR_Cas9-CRISPR_Genomic_Loci-Fig1.png

文獻(xiàn)中已描述45個(gè)不同的cas蛋白家族，每一個(gè)家族在合成cRNA、整合新的間隔序列和切割入侵DNA中具有不同的作用。CRISPR-Cas系統(tǒng)通常分為三類，這取決于Cas蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)：I型、II型和III型。目前常用于基因組編輯的CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一個(gè)Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，它是從化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）改編而來的。

CRISPR系統(tǒng)的組成及機(jī)理

內(nèi)切酶 + 短引導(dǎo)RNA

內(nèi)切酶是化膿性鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌CAS9核酸酶蛋白。CAS9核酸酶具有兩個(gè)DNA剪切結(jié)構(gòu)域（Ruvc1和HNH-like核酸酶域），可剪切雙鏈DNA使雙鏈斷裂（DSB；double strand breaks）。

gRNA是一種工程化的單鏈嵌合體RNA，結(jié)合了細(xì)菌tracrRNA的支架功能和細(xì)菌crRNA的特異性。gRNA 5'端的最后20bp作為一個(gè)歸位裝置，通過RNA-DNA堿基配對(duì)，將CAS9/GRNA復(fù)合物招募到PAM(protospacer adjacent motif )上游特定的DNA靶位。不同菌株和不同類型的CRISPR-Cas蛋白之間的PAM序列不同，化膿性鏈球菌Cas9的序列是5’-NGG。目前的CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以直接用于任何5’-N20-NGG DNA序列，并產(chǎn)生精確的雙鏈斷裂。然后，通過在幾乎所有細(xì)胞類型和生物體中發(fā)現(xiàn)的兩種通用修復(fù)機(jī)制修復(fù)DSB：非同源末端連接（NHEJ；the non-homologous end-joining ）或同源定向修復(fù)（HDR；the homology-directed repair）。

CRISPR_Cas9-Cas9_Nuclease-Fig2.png

非同源末端連接修復(fù)（NHEJ）

NHEJ修復(fù)路徑是一種容易出錯(cuò)的修復(fù)機(jī)制，用于在沒有合適的修復(fù)模板的情況下修復(fù)雙鏈斷裂。NHEJ通路試圖將DSB的切割端連接在一起。然而，這一過程往往導(dǎo)致DSB位點(diǎn)的插入或刪除（indels）突變，導(dǎo)致移位或引入永久性破壞目標(biāo)基因開放閱讀框的成熟前終止密碼子。盡管NHEJ的INDEL結(jié)果很大程度上是隨機(jī)的，但是科學(xué)家們可以通過將gRNA定位于相關(guān)基因的N末端來確保最大程度的基因破壞；這將確?？蚣芤莆煌蛔儾粫?huì)導(dǎo)致部分功能性基因產(chǎn)物。在利用NHEJ修復(fù)通路時(shí)，設(shè)計(jì)第一或第二外顯子中的gRNA并避免靶基因的內(nèi)含子區(qū)是一個(gè)很好的實(shí)踐。

CRISPR_Cas9-Non_Homologous_End_Joining_NHEJ-Fig3.jpg

CAS9核酸酶同源定向修復(fù)（HDR）

除NHEJ，細(xì)胞還能夠利用一種更精確的修復(fù)機(jī)制，即同源定向修復(fù)（HDR）途徑。這種修復(fù)機(jī)制可以用來引入特定的核苷酸修飾基因組DNA。在這種方法中，將與預(yù)期編輯位點(diǎn)上游和下游序列高度同源的DNA修復(fù)模板連同適當(dāng)?shù)膅RNA和CAS9核酸酶一起引入細(xì)胞。在這種合適的模板存在下，不易出錯(cuò)的HDR機(jī)制可以通過重組忠實(shí)地對(duì)CAS9誘導(dǎo)的DSB站點(diǎn)進(jìn)行所需的更改。在設(shè)計(jì)修復(fù)模板時(shí)，請(qǐng)確保目標(biāo)序列沒有緊跟PAM序列，或者PAM序列被排除或變異。這是為了避免使用相同的CRISPR-CAS9系統(tǒng)對(duì)修復(fù)模板進(jìn)行降解。

CRISPR_Cas9-Homology_Directed_Repair_HDR-Fig4.png

PAM識(shí)別序列

CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以通過gRNA的設(shè)計(jì)針對(duì)任何基因組區(qū)域的特異性取決于位于目標(biāo)序列下游的PAM序列。作為細(xì)菌和古細(xì)菌免疫系統(tǒng)，PAM識(shí)別序列激活CAS9的核酸酶域，從而作為區(qū)分自我和非自我的手段（如：阻止CRISPR基因座被靶向）。

CRISPR_Cas9-Protospacer_Adjacent_Motif_PAM-Fig5.png

PAM識(shí)別序列因來源于CAS9核酸酶的細(xì)菌種類和類型而異。最常用的II型CRISPR系統(tǒng)使用來自化膿性鏈球菌的CAS9核酸酶。這種特殊的核酸酶在GRNA序列的3'端識(shí)別5'-NGG。其他市售CAS9可識(shí)別其他PAM序列。

Table 1: PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases.

Cas9 Nickase 和 Cas9 Double Mutant

Cas9 Nickase

Cas9 Nickase是Cas9的一種突變形式，其RuvC1 或HNH-like核酸酶域中分別有D10A 或H840A 突變，這種突變形式導(dǎo)致在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生單鏈刻痕而不是雙鏈斷裂。由于單鏈斷裂（或缺口）通常使用完整的互補(bǔ)DNA鏈作為修復(fù)模板通過HDR 途徑快速修復(fù)，因此Cas9 Nickase可將脫靶效應(yīng)最小化。

CRISPR_Cas9-Cas9_Nickase-Fig6.png

為了利用Cas9 Nickase進(jìn)行基因組編輯，需要兩個(gè)gRNA。這兩個(gè)gRNA需設(shè)計(jì)在相反的DNA鏈上，但其距離很近，以確保一旦兩個(gè)鏈被Cas9 Nickase切割，DSB就會(huì)被誘導(dǎo)。這對(duì)Cas9 Nickase修改減少了脫靶效應(yīng)，因?yàn)樾鑳蓚€(gè)gRNA共同產(chǎn)生一個(gè)DSB。一旦形成DSB，NHEJ或HDR路徑將被激活以完成基因組編輯過程。

CRISPR_Cas9-Cas9_Nickase_Mechanism-Fig7.png

如果共同引入含有所需修飾的修復(fù)模板DNA與gRNA和Cas9 nickase，則Cas9 Nickase也可用于通過同源重組產(chǎn)生核苷酸修飾。

Table 2: Cas9 Nickase and Nuclease Usage in Gene Disruption and Specific Gene Modification

Cas9 Double Mutant

Cas9雙突變體或Null突變體是通過突變野生型Cas9的兩個(gè)切割結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生的。 這種Cas9蛋白保留了通過gRNA：基因組DNA堿基配對(duì)與基因組DNA結(jié)合的能力。 與Cas9核酸酶和Cas9 Nickase可以實(shí)現(xiàn)永久性基因破壞不同，Cas9 Null突變體不引入任何基因組修飾。 通過將Cas9雙突變體與其他效應(yīng)蛋白融合，CRISPR Cas9系統(tǒng)可以將其作用擴(kuò)展到基因調(diào)控，基因組成像，染色質(zhì)或DNA修飾以及染色質(zhì)免疫沉淀。

CRISPR_Cas9-Non_Homologous_End_Joining_NHEJ-Fig8.png

spCas9, saCas9, and Cpf1 核酸酶

Table 3: Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases

spCas9

large size and G-rich PAM sequence

Cpf1 Nuclease

Cpf1于2015年底由麻省理工學(xué)院的Feng Zhang小組發(fā)現(xiàn)。在16種候選Cpf1蛋白中，兩種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最具潛力的高特異性基因組編輯工具：asCpf1和lb2Cpf1。這些核酸酶在人類細(xì)胞中具有與常用spCas9相當(dāng)?shù)陌邢蚯懈钚省?/p>

Cpf1允許新的定位可能性，因?yàn)樗R(shí)別富含T的PAM位點(diǎn)。與Cas9的富含G的PAM要求相比，這顯著擴(kuò)大了可能的基因組目標(biāo)的范圍。雖然Cas9可能是靶向富含G的區(qū)域的優(yōu)選核酸酶，但Cpf1可用于靶向富含T的區(qū)域。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Cpf1可以靶向如支架/基質(zhì)附著區(qū)域和著絲粒DNA的難以延伸的DNA片段。使用Cpf1還可以探索由富含AT的結(jié)構(gòu)域控制的細(xì)菌基因組，例如引起瘧疾的惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）。同樣，在Cas9的表達(dá)有毒的情況下，Cpf1可能是Cas9的有用替代品，如在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）和幾種藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）中所見。

Cpf1需要較短的guide RNA才能運(yùn)作。雖然Cas9需要tracrRNA的存在來處理crRNA，但Cpf1可以自己處理pre-crRNA。這對(duì)于生物技術(shù)特別感興趣，因?yàn)榕c用于Cas9的~100nt tracrRNA / crRNA雜交體相比，Cpf1可以僅用~42nt crRNA靶向。這將工程化sgRNA的大小減少了一半以上，同時(shí)還簡(jiǎn)化了與合成和化學(xué)修飾相關(guān)的方法和成本。這種自編輯功能也使Cpf1成為多重基因組編輯的最佳選擇，因?yàn)楦嗟膕gRNA可能適合一個(gè)載體。

另一個(gè)顯著差異是Cas9在切割后產(chǎn)生平端，而Cpf1留下可用于定向克隆的粘性5'突出端。產(chǎn)生粘性末端的其他方法，例如限制酶消化，具有比Cpf1更短的識(shí)別序列，因此切割性較低。已經(jīng)利用Cpf1的這種特性在體外進(jìn)行高度特異性的DNA組裝。在體內(nèi)使用這種方法，科學(xué)家們可以對(duì)非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元）進(jìn)行DNA敲入，通過HDR進(jìn)行基因組編輯尤其具有挑戰(zhàn)性。

Cpf1切割PAM位點(diǎn)下游18-23bp的DNA，導(dǎo)致NHEJ修復(fù)雙鏈DNA斷裂后對(duì)識(shí)別序列沒有破壞。導(dǎo)致Cpf1能夠進(jìn)行多輪DNA切割，并且增加了進(jìn)行所需基因組編輯的機(jī)會(huì)。相比之下，由于Cas9僅在PAM位點(diǎn)上游切割3bp，因此NHEJ途徑導(dǎo)致indel突變，其破壞識(shí)別序列，從而防止進(jìn)一步的切割輪次。理論上，重復(fù)的DNA切割輪次應(yīng)該導(dǎo)致Cpf1導(dǎo)致靶基因的沉默增加，并且在敲入實(shí)驗(yàn)的情況下，發(fā)生同源定向修復(fù)的機(jī)會(huì)更大。
Zhang等人的一項(xiàng)研究。表明Cpf1介導(dǎo)的基因組編輯可用于糾正誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和小鼠的肌營(yíng)養(yǎng)不良基因突變。這導(dǎo)致基因表達(dá)恢復(fù)，小鼠癥狀得到糾正。 Cpf1也已成功用于蛋白質(zhì)-sgRNA復(fù)合物中，以突變大豆和煙草植物中的基因。

saCas9 Nuclease

雖然化膿性鏈球菌Cas9（S. pyogenes Cas9; spCas9）是最常用的CRISPR核酸酶，但最近的注意力已轉(zhuǎn)向從金黃色葡萄球菌中分離的微型Cas9核酸酶（S. aureus; saCas9）。這種小核酸酶通過使生物體內(nèi)基于CRISPR的基因編輯更加可行，具有改變生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)業(yè)的巨大潛力。 SaCas9和spCas9能夠以相當(dāng)?shù)男试隗w內(nèi)切割真核DNA。但saCas9具有幾個(gè)特性，使其對(duì)某些應(yīng)用更有用。

SaCas9比spCas9小約1kb，使其能夠更有效地包裝到較小容量的腺相關(guān)病毒（AAV）中，為調(diào)控元件，crRNAs和tracrRNAs留下額外空間。通過將Cas9和sgRNA包含在一個(gè)構(gòu)建體（稱為All-In-One載體）中，可以在一個(gè)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟中完成Cas9表達(dá)和sgRNA靶向。由于其低免疫原性和選擇性感染某些組織類型的能力，AAV是用于體內(nèi)研究的優(yōu)選基因遞送方法。

同樣，與spCas9相比，saCas9為基因組編輯開辟了新的可能性，因?yàn)樗哂胁煌亩ㄎ荒芰Α?spCas9識(shí)別5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9識(shí)別5'-NNGRRT-3'?？捎糜赑AM序列的更多種類意味著可用于基因組編輯的增加的基因座數(shù)量。當(dāng)需要使用同源定向修復(fù)精確編輯基因時(shí)，這是特別有益的，因?yàn)楫?dāng)識(shí)別序列非常接近待編輯區(qū)域時(shí)HDR最有效。

saCas9較長(zhǎng)的PAM的一個(gè)缺點(diǎn)是，該序列在基因組中的發(fā)生頻率低于spCas9的PAM序列，限制了其潛在的效用。 然而，saCas9較長(zhǎng)的PAM序列應(yīng)該有助于防止脫靶的切割，因?yàn)樗哂懈叩奶禺愋浴?/p>

麻省理工學(xué)院張實(shí)驗(yàn)室于2015年進(jìn)行的一項(xiàng)研究調(diào)查了體內(nèi)saCas9的表現(xiàn)。 他們將攜帶saCas9的AAV注射到小鼠體內(nèi)以破壞PCSK9基因，該基因與家族性高膽固醇血癥有關(guān)。 這導(dǎo)致1周后肝組織中基因修飾> 40％，注射后4周沒有毒性跡象。 最近的其他工作已經(jīng)用于開發(fā)具有使用分子進(jìn)化的松弛PAM識(shí)別特異性的變體saCas9。 與野生型saCas9相比，這種變體允許更大范圍的潛在編輯目標(biāo)，同時(shí)保留其小尺寸傳達(dá)的優(yōu)勢(shì)。

為什么有些研究人員更喜歡saCas9和spCas9？

1. saCas9更緊湊，但具有與spCas9相同的基因編輯能力。
2. saCas9靶向不同的基因組位點(diǎn)而不是spCas9：saCas9具有與spCas9不同的PAM序列，使其成為spCas9的補(bǔ)充工具。
3. saCas9具有降低的脫靶切割風(fēng)險(xiǎn)：由于它的PAM序列在基因組中更長(zhǎng)且更罕見，因此saCas9與靶DNA的非特異性相互作用的風(fēng)險(xiǎn)較低。

4. saCas9在體外比spCas9更有效：與spCas9相比，saCas9需要更少的酶，更少的時(shí)間來完成DNA切割。

   
   
   CRISPR-saCas9-vs-spCas9-infographic-fullsize-1.jpg

基于蛋白質(zhì)的基因組編輯工具的比較

兩種常見的基于蛋白質(zhì)的基因組編輯工具

鋅指核酸酶（Zinc-finger Nucleases; ZFNs）
轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases; TALENs）

Table 4: Comparison of current genome editing technologies

巨人的肩膀

An Intro to CRISPR Cas9