2022年2月山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊在Cell Mol Gastroenterol Hepatol?（IF=9.225）發(fā)表文章，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序剖析了人類遠(yuǎn)端膽管癌（dCCA）的異質(zhì)性景觀和腫瘤微環(huán)境（TME）組成。該研究旨在揭示遠(yuǎn)端膽管癌腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性。該研究中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Cell Mol Gastroenterol?Hepatol

【發(fā)布時間】2022年2月

【影響因子】9.225

【關(guān)鍵詞】單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，遠(yuǎn)端膽管癌

研究背景

遠(yuǎn)端膽管癌（dCCA）是一種發(fā)生在遠(yuǎn)端膽總管的上皮細(xì)胞惡性腫瘤，約占所有膽管癌病例的40%。dCCA 是一種高度致命的疾病，通常具有顯著的細(xì)胞異質(zhì)性。全面探索細(xì)胞多樣性和腫瘤微環(huán)境（TME）對于描述驅(qū)動 dCCA 進(jìn)展的機(jī)制至關(guān)重要。

研究思路

研究思路圖

研究結(jié)果

1、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示人類 dCCA 細(xì)胞圖譜

構(gòu)建了 4 名 dCCA 患者的 4 份 dCCA 樣本和 3 份匹配的相鄰正常膽管組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖 1，A）。共 30,860 個細(xì)胞進(jìn)一步注釋為 11 種不同細(xì)胞類型，包括 T 細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B 細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肥大細(xì)胞和組織干細(xì)胞（圖 1，B 和 C）。熱圖展示了每種細(xì)胞類型的 top 3 的差異基因（DEG）（圖 1，D）。條形圖顯示了每個樣本中細(xì)胞類型的比例以及每種細(xì)胞類型中每個樣本的比例（圖 1，E 和 F）。

圖1 scRNA-seq 研究人類 dCCA 的單細(xì)胞圖譜

進(jìn)一步量化響應(yīng) dCCA 惡性腫瘤的細(xì)胞類型豐度的變化，確定了跨越 KNN 圖的 2446 個鄰接，其中 77 個顯示了正常（N）和惡性（M）條件之間豐度差異的證據(jù)（圖 2，B）。將差異豐度結(jié)果與之前確定的所有細(xì)胞群進(jìn)行比較，恢復(fù)了除肥大細(xì)胞群外的所有細(xì)胞群中差異豐度的鄰接（圖 2，C）。?

圖2 正常（N）和惡性（M）樣本之間的差異豐度

2、惡性細(xì)胞亞群在人類 dCCA 中表現(xiàn)出腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

所有上皮細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為 6 個主要亞群（圖 3，A），包括 1 個正常上皮細(xì)胞亞群（N）和 5 個惡性亞群（M1-M5），顯示出不同程度的 CNV 評分（圖 3，B 和 C）。亞群 M1 是最主要的惡性亞群，而 M5 數(shù)量最少（圖 3，D）。5 種惡性亞型表現(xiàn)出很大程度的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖 3，A）。每種惡性亞型都顯示了特異表達(dá)的 DEG（圖 3，E 和 F）。惡性組織中有 212 個上調(diào)基因，正常組織中有 70 個相對高表達(dá)的基因（圖 3，G）。KEGG 功能富集分析表明，在惡性腫瘤中高表達(dá)的基因主要富集于細(xì)胞連接、ErbB 和 Notch 等信號通路（圖 3，H）。

圖3 人類 dCCA 中惡性成分的全面細(xì)胞概述和異質(zhì)性

通過免疫組織化學(xué)（IHC）和 qPCR 方法驗證每個亞群的 marker 基因表達(dá)，并顯示了每個樣本的形態(tài)學(xué)特征（圖 4）。結(jié)果與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，尤其是在蛋白質(zhì)水平上。

圖4 Marker 基因的表達(dá)驗證

接下來，采用 SCENIC 方法分析所有惡性上皮細(xì)胞亞群并識別不同信號性質(zhì)的潛在轉(zhuǎn)錄因子（TF）（圖 5，A）。發(fā)現(xiàn)了所有惡性亞群的共同潛在 TF，例如 STAT3 和 Rel（圖 5，B），SMARCC2、EGR1、IKZF1、STAT1 和 POU2F3 分別為 M1 到 M5 中具有代表性的基礎(chǔ) TF（圖 5，A 和 B）。所有上皮細(xì)胞的偽時間軌跡圖顯示，正常上皮細(xì)胞和每個惡性細(xì)胞亞群形成一個連續(xù)體，但惡性亞群彼此分離，具有不同的表達(dá)特征，證實(shí)了人 dCCA 中惡性亞克隆的異質(zhì)性（圖 5，C）。正常的上皮細(xì)胞群形成了一個根，有 2 個主要的軌跡分支，將 M1 與 M2、M3 和 M5 分開（圖 5，D）?；蚣儺惙治觯℅SEA）表明所有 M 子集共享一些共同的激活特征，M1 和 M2 亞組共享最常見的途徑（圖 5，E）。

圖5 人 dCCA 組織中惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)異質(zhì)性

3、惡性細(xì)胞表現(xiàn)出與 17 號染色體相反的改變狀態(tài)

有趣的是，低和高 CNV 的 M 亞組特征分別是 chr17q12 - chr17q21.2 的擴(kuò)增或缺失（圖 3，C）。該區(qū)域涉及多個顯著的腫瘤相關(guān)基因，所有這些基因在 M1 中均高表達(dá)，而與 N 組相比，它們在 M2 至 M5 中的表達(dá)水平相對較低（圖 5，F(xiàn)）。偽時間軌跡表達(dá)也顯示了這些基因在亞組之間差異的表達(dá)分布（圖 5，G）。并且與 CCA 患者的患者總生存概率密切相關(guān)（圖 5，H）。

4、人 dCCA 腫瘤中富含細(xì)胞毒性 CD8+ T 細(xì)胞和免疫抑制性腫瘤浸潤性 Treg

在非癌性膽道組織中，僅檢測到 na?ve CD4+ 和 na?ve CD8+ T 細(xì)胞（圖 6，A），而在癌組織中，鑒定出 4 個不同的 T 細(xì)胞亞群（圖 6，B）。Na?ve T 細(xì)胞在腫瘤和非腫瘤組織中均占主導(dǎo)地位，細(xì)胞毒性 CD8+ T 細(xì)胞是 dCCA 中的主要效應(yīng)子（圖 6，C 和 D）。接下來，使用 iTALK 研究正常組織或腫瘤組織中 T 細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，ERBB2 受體在腫瘤組織中增強(qiáng)，表明阻斷 ERBB2 信號傳導(dǎo)可能會影響惡性細(xì)胞的增殖作用（圖 6，E）。

圖6 人類 dCCA 中的浸潤免疫細(xì)胞亞型景觀

5、dCCA 和 iCCA 的單細(xì)胞數(shù)據(jù)比較

與已發(fā)表的肝內(nèi)膽管癌（iCCA）單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，證實(shí)了 iCCA 和 dCCA 之間不同的表達(dá)變化情況（圖 7，C）。總共檢測到 45 個基因在 iCCA 中顯著上調(diào)，而 17 個基因在 dCCA 中過表達(dá)（圖 7，D）。GSEA分析表明，二者富集了不同的激活信號通路（圖 7，E）。

圖7 ?單細(xì)胞數(shù)據(jù)與批量數(shù)據(jù)以及 dCCA 和 iCCA 之間的比較

總結(jié)

本研究全面繪制了人類 dCCA 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀，揭示了高水平的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性以及對 dCCA 具有潛在臨床意義的關(guān)鍵生物學(xué)特征。

參考文獻(xiàn)

Li H, Qu L, Yang Y, Zhang H, Li X, Zhang X. Single-cell transcriptomic architecture unraveling the complexity of tumor heterogeneity in distal cholangiocarcinoma [published online ahead of print, 2022 Feb 24].?Cell Mol Gastroenterol Hepatol.?2022; S2352-345X（22）00041-8.doi:10.1016/j.jcmgh.2022.02.014