N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA上最常見的化學(xué)修飾之一，對基因表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要。METTL3和METTL14形成的異二聚體復(fù)合體（METTL3-METTL14復(fù)合體）是mRNA上m6A修飾的主要催化酶。已有研究表明，METTL3-METTL14異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其突變?nèi)绾斡绊懠谆禺愋陨胁幻鞔_。此外，METTL14的R298位點(diǎn)（METTL14R298P）是癌癥中最常突變的位點(diǎn)之一，傳統(tǒng)認(rèn)為其導(dǎo)致功能缺失，但其功能尚未完全闡明。

近日，美國得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Yunsun Nam團(tuán)隊揭示了癌癥相關(guān)突變?nèi)绾瓮ㄟ^改變METTL3-METTL14復(fù)合體對RNA甲基化（m6A）的特異性來促進(jìn)腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，METTL14的R298P突變能夠改變m6A的序列偏好，優(yōu)先修飾含有GGAU motif的非典型位點(diǎn)，導(dǎo)致非典型m6A修飾位點(diǎn)累積，激活促癌通路（如WNT信號），從而促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤生長。這一發(fā)現(xiàn)為理解癌癥中RNA修飾的調(diào)控機(jī)制提供了新視角，并為開發(fā)癌癥靶向治療提供了潛在新靶點(diǎn)。相關(guān)研究成果以“Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of?METTL3-METTL14?”為題發(fā)表于《SCIENCE ADVANCES》期刊。

標(biāo)題：Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14（癌癥突變重新連接METTL3-METTL14的RNA甲基化特異性）

發(fā)表時間：2024年12月20日

發(fā)表期刊：SCIENCE ADVANCES（Sci Adv）

影響因子：IF 11.7 / 1區(qū)

技術(shù)平臺：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq、IVM-seq（體外甲基化測序）?

RNA的化學(xué)修飾對轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控至關(guān)重要。METTL3-METTL14復(fù)合體負(fù)責(zé)mRNA中大部分N6-甲基腺苷（m6A）修飾的生成，而甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)失調(diào)與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾的序列偏好變化可以促進(jìn)癌變。研究結(jié)果表明，癌癥患者的METTL14R298P錯義突變體在體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因小鼠模型中均表現(xiàn)出增強(qiáng)的惡性細(xì)胞生長能力，但并未導(dǎo)致mRNA中整體m6A水平上升。該突變甲基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)外優(yōu)先修飾含有GGAU motif的非典型位點(diǎn)。與典型位點(diǎn)類似，GGAU背景下的m6A修飾能夠被YTH家族的reader蛋白識別，但其被去甲基化酶ALKBH5去除的效率較低。結(jié)合生化和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，作者提出了METTL3-METTL14如何選擇特定RNA序列進(jìn)行甲基化的模型。本研究強(qiáng)調(diào)了序列特異性m6A修飾的重要性，并揭示了GGAU甲基化增加可促進(jìn)癌變。

研究摘要：異常調(diào)控的METTL3-METTL14會導(dǎo)致不同的m6A修飾狀態(tài)

研究方法

前期實驗：

l 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)METTL14野生型（WT）、R298P突變型和D312A突變型的HepG2肝癌細(xì)胞系。

l 通過質(zhì)譜分析揭示不同細(xì)胞系的整體m6A水平。

l 通過細(xì)胞遷移和侵襲實驗評估不同METTL14突變對細(xì)胞行為的影響。

機(jī)制探索：

l 利用MeRIP-seq分析不同METTL14突變對m6A修飾圖譜的影響。

l? 通過IVM-seq和SELEX實驗驗證METTL14R298P突變對RNA序列偏好的改變。

l? NA-seq與蛋白質(zhì)組學(xué)：分析基因表達(dá)與通路變化。

后期驗證：

l? 利用體外甲基化和去甲基化實驗驗證突變對m6A修飾和去修飾的影響。

l 通過動物模型驗證METTL14R298P突變對腫瘤生長的影響。

結(jié)果圖形

（1）METTL14R298P導(dǎo)致培養(yǎng)物和小鼠中的惡性細(xì)胞生長

圖1. METTL14R298P在體外培養(yǎng)和小鼠模型中均促進(jìn)惡性細(xì)胞生長。 A-B. 表達(dá)EGFP或EGFP-METTL14變體（WT、R298P或D312A）的HepG2穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞遷移（A）和侵襲（B）實驗。 C.?? HDT分析的小鼠腫瘤發(fā)生實驗示意圖。 D.?? 注射后42天的84天小鼠的肝臟與體重比值，來自2-3個實驗組（14只WT、10只R298P、7只D312A）。 E.?? 腫瘤發(fā)生實驗中小鼠肝臟的顯微照片。 F.?? 代表性完整肝臟和腫瘤組織圖像。 G-H. 通過IPA對RNA-seq（n=3）數(shù)據(jù)進(jìn)行的差異表達(dá)分析，包括典型通路（G）和疾病與功能（H）模塊。 I-J.? 對WNT通路（I）和細(xì)胞運(yùn)動（J）的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析。

（2）METTL14R298P促進(jìn)轉(zhuǎn)錄組中不同位點(diǎn)的m6A修飾

圖2. METTL14R298P促進(jìn)轉(zhuǎn)錄組中特定RNA位點(diǎn)的m6A修飾。 A. 使用表達(dá)EGFP或METTL14（WT、R298P或D312A）的HepG2穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行m6A-seq實驗。每個細(xì)胞系的三個重復(fù)中重疊的peaks數(shù)以交集形式顯示在上方（總數(shù)，黑色字體），而經(jīng)過四組比較后特有的peaks數(shù)顯示在下方（特有，紅色字體）。 B. 對每個細(xì)胞系的特異性m6A位點(diǎn)進(jìn)行的motif分析（紅色數(shù)字對應(yīng)A）。方框中顯示了第四個位置處Cyt（胞嘧啶）和Ura（尿嘧啶）的概率百分比。 C. 與EGFP相比的m6A-seq peaks。上方展示了peaks信號比較的工作流程示意圖。數(shù)據(jù)顯示為中位數(shù)和四分位數(shù)，其中WT為33549，R298P為28892，D312A為26703。括號標(biāo)記了頂部或底部的5個百分位數(shù)。 D. 對TOP 5%的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行motif分析（藍(lán)色括號對應(yīng)C）。 E. 顯示METTL14R298P特異性peaks（粉色）的示例轉(zhuǎn)錄本的瀏覽器軌跡。標(biāo)記了peak位點(diǎn)（粉色刻度）、序列和甲基化位點(diǎn)（彩色）。 F. 對至少包含一個R298P細(xì)胞特異性m6A peaks（圖2A）和一個較高的m6A峰（相對EGFP的前5%）（圖2C）的基因（n=258）進(jìn)行的GO分析。

（3）METTL14R298P偏好非典型GGAU序列

圖3. METTL14R298P偏好非典型GGAU序列。 A.? IVM-seq（體外甲基化測序）工作流程。使用帶有20個核苷酸隨機(jī)片段的寡核苷酸生成體外甲基化的RNA池。通過抗m6A抗體篩選出的甲基化RNA進(jìn)行高通量測序。 B.? 對METTL3-METTL14復(fù)合體變體甲基化RNA進(jìn)行IVM-seq input的motif分析。 C.? 重編程METTL3-METTL14變體對源MALAT1（在第4個或第5位點(diǎn)有單個核苷酸變化）的一系列RNA片段的體外甲基化活性分析。 D.? 每個METTL14變體對GGAU底物相對于GGAC的體外甲基化活性。 E.?? 在不同序列和結(jié)構(gòu)下RNA底物的體外甲基化。

（4）METTL14R298P生成的m6A修飾對ALKBH5去甲基化更具抗性

圖4. METTL14R298P生成的m6A對ALKBH5去甲基化的抗性更強(qiáng)。 A-B.? YTHDF2和ALKBH5與含有GGAC或GGAU的RNA（有或沒有m6A修飾）的凝膠遷移率變化（gel-shift）實驗。 C-D.? FTO和ALKBH5對甲基化RNA（0.5 μM）的體外去甲基化活性的定量分析。

（5）METTL14R298PRNA特異性改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

圖5. METTL14突變體的新型特異性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 A.??? WT（野生型）METTL3-METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)以供參考，SAM（青色）和R298側(cè)鏈以棒狀表示。 B-C.? METTL3-METTL14復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)在結(jié)合點(diǎn)附近的特寫視圖。 D.??? 使用含有GGAC或GGAU的RNA對指示的突變蛋白進(jìn)行體外甲基化實驗。 E.??? RNA（粉色）的模型，包含待甲基化為m6A的腺苷（Ade）和下一個核苷酸，與WT METTL3（綠色或淺藍(lán)色）和METTL14WT（橙色）或METTL14R298P（灰色）復(fù)合體的疊加結(jié)構(gòu)結(jié)合。通過觀察到的側(cè)鏈重排，可以區(qū)分胞嘧啶（Cyt）或尿嘧啶（Ura）中嘧啶環(huán)的第3和第4位（白色）（右側(cè)顯示化學(xué)結(jié)構(gòu)）。

易小結(jié)

本研究首次揭示了METTL14R298P突變通過改變m6A修飾的序列偏好促進(jìn)腫瘤發(fā)生的新機(jī)制。研究首先結(jié)合多種技術(shù)平臺，從細(xì)胞、分子和動物模型層面系統(tǒng)研究了METTL14突變的功能。隨后通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)方法，揭示了METTL3-METTL14復(fù)合體識別RNA序列的分子機(jī)制。研究揭示了非典型m6A修飾在癌癥中的重要作用，為開發(fā)新的癌癥治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

1)?細(xì)胞和動物模型驗證：

?METTL14R298P突變顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

在動物模型中，表達(dá)METTL14R298P的細(xì)胞形成的腫瘤更大、更頻繁，且具有更高的肝組織替代率。

2)???m6A修飾圖譜分析：

METTL14R298P突變改變了m6A修飾的序列偏好，優(yōu)先修飾含有GGAU motif的位點(diǎn)。

這些非典型m6A修飾能夠被YTH家族reader蛋白識別，但對ALKBH5去甲基化酶的敏感性降低。

3)???分子機(jī)制揭示：

通過晶體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)R298P突變導(dǎo)致METTL3-METTL14復(fù)合體的構(gòu)象改變，從而改變了對RNA序列的偏好性。

R298P突變通過增加GGAU位點(diǎn)的甲基化，影響WNT信號通路和細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)基因的表達(dá)。

MeRIP-seq在本研究中的重要作用

檢測m6A修飾位點(diǎn)：通過MeRIP-seq，研究者全面分析了不同METTL14突變對m6A修飾圖譜的影響，揭示了R298P突變導(dǎo)致的m6A修飾位點(diǎn)偏好性改變。

發(fā)現(xiàn)非典型修飾位點(diǎn)：MeRIP-seq幫助研究者發(fā)現(xiàn)METTL14R298P突變優(yōu)先修飾含有GGAU motif的非典型位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)是本研究的核心突破。

關(guān)聯(lián)基因表達(dá)與m6A修飾：結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，MeRIP-seq結(jié)果幫助研究者分析m6A修飾變化與基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，揭示了突變對WNT信號通路和細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)基因表達(dá)的影響。

參考文獻(xiàn)：

ZhangC, Scott RL, Tunes L, Hsieh MH, Wang P, Kumar A, Khadgi BB, Yang YY, DoxtaderLacy KA, Herrell E, Zhang X, Evers B, Wang Y, Xing C, Zhu H, Nam Y. Cancermutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14. Sci Adv.2024 Dec 20;10(51):eads4750. doi: 10.1126/sciadv.ads4750.