StatQuest-對(duì)RNA-seq的介紹

RNA-seq的三個(gè)主要步驟

  1. 建庫
  2. 測(cè)序
  3. 數(shù)據(jù)分析
1. 建庫
workflow

step1 分離RNA
step2 打斷RNA

測(cè)序機(jī)器一次最多只能測(cè)200-300bp

step3 逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA

DNA比RNA更穩(wěn)定，更易擴(kuò)增和修飾

step4 加接頭

1)讓測(cè)序機(jī)器識(shí)別序列片段
2)用不同的接頭同時(shí)測(cè)序不同的樣品

step5 PCR擴(kuò)增
step6 QC

2. 測(cè)序
  • 原理：序列片段垂直的連接到“flow cell”上，測(cè)序儀通過特異性熒光探針連接到堿基，一層一層測(cè)序，每測(cè)一層拍照識(shí)別，識(shí)別后洗脫顏色繼續(xù)測(cè)序。
  • 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的產(chǎn)生原因：

    1. 有些熒光探針會(huì)失效

    2. 低多樣性的產(chǎn)生（一般發(fā)生在測(cè)序開始，機(jī)器識(shí)別序列片段位置的時(shí)候）

  • 測(cè)序結(jié)果
    • @ 唯一的序列ID標(biāo)識(shí)符，可選的序列描述內(nèi)容，以空格分開
    • 序列信息
    • +后為空或加上@后信息
    • 堿基質(zhì)量字符 可以按一定規(guī)則轉(zhuǎn)換為堿基質(zhì)量得分，進(jìn)而反映該堿基的錯(cuò)誤率。
  • 比對(duì)參考基因組

  • 過濾低質(zhì)量基因reads


    正常read

    低質(zhì)量read
  • reads計(jì)數(shù)

  • 標(biāo)準(zhǔn)化reads計(jì)數(shù)


    舉例--為什么要標(biāo)準(zhǔn)化

    影響計(jì)數(shù)的原因：1.reads質(zhì)量 2.reads濃度

3.數(shù)據(jù)分析
  • PCA畫圖：1.可視化差異 2.排除異常樣本
  • 差異表達(dá)分析：三大R包
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