need:表達矩陣 分組矩陣，值要是整數(shù)
DESeq2和EdgeR都可用于做基因差異表達分析，主要也是用于RNA-Seq數(shù)據(jù)，同樣也可以處理類似的ChIP-Seq,shRNA以及質譜數(shù)據(jù)。
這兩個都屬于R包，其相同點在于都是對count data數(shù)據(jù)進行處理，都是基于負二項分布模型。因此會發(fā)現(xiàn)，用兩者處理同一組數(shù)據(jù)，最后在相同閾值下篩選出的大部分基因都是一樣的，但是有一部分不同應該是由于其估計離散度的不同方法所導致的。
library(DESeq2)
library(limma)
library(pasilla)#示例數(shù)據(jù)包
data(pasillaGenes)
exprSet=counts(pasillaGenes)? ##做好表達矩陣
group_list=pasillaGenes$condition##做好分組因子即可
(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), group_list=group_list))
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? colData = colData,#Rows of colData correspond to columns of countData
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? design = ~ group_list)
##上面是第一步第一步，構建dds這個對象，需要一個表達矩陣和分組矩陣?。?！
dds2 <- DESeq(dds)? ##第二步，直接用DESeq函數(shù)即可
resultsNames(dds2)#results extracts a result table from a DESeq analysis giving base means across samples,? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? log2 fold changes, standard errors, test statistics, p-values and adjusted p-values;? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? resultsNames returns the names of the estimated effects (coefficents) of the model;? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? removeResults returns a DESeqDataSet object with results columns removed.
res <-? results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated"))#this argument specifies what comparison to extract from the object to build a results table
## 提取你想要的差異分析結果，我們這里是treated組對untreated組進行比較
resOrdered <- res[order(res$padj),]#padj排序
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
可以看到程序非常好用！
它只對RNA-seq的基因的reads的counts數(shù)進行分析，請不要用RPKM等經過了normlization的表達矩陣來分析。
值得一提的是DESeq2軟件獨有的normlization方法！
rld <- rlogTransformation(dds2)? ## 得到經過DESeq2軟件normlization的表達矩陣！
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)#指定符號的大小
n.sample=ncol(exprSet)#樣本數(shù)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet)
hist(exprSet_new)
第一張圖也是箱型圖
看這個圖就知道了，它把本來應該是數(shù)據(jù)離散程度非常大的RNA-seq的基因的reads的counts矩陣經過normlization后變成了類似于芯片表達數(shù)據(jù)的表達矩陣，然后其實可以直接用T檢驗來找差異基因了！
但是，如果你的分組不只是兩個，就復雜了，你需要再仔細研讀說明書，甚至你可能需要咨詢實驗設計人員或者統(tǒng)計人員！
