使用Perseus軟件進(jìn)行1D和2D annotation enrichment分析
某天，在某篇蛋白組學(xué)文獻(xiàn)中看到這么一個(gè)分析，稱為2D annotation enrichment的方法。作者使用2D annotation enrichment比較了自己的蛋白組數(shù)據(jù)集和先前研究中蛋白組數(shù)據(jù)集的蛋白表達(dá)的差異，并將這種差異關(guān)聯(lián)到富集的通路上進(jìn)行比較，以闡述二者的一致性和區(qū)別。圖B是2D annotation enrichment的結(jié)果，橫軸為自己的蛋白組數(shù)據(jù)，縱軸為先前報(bào)道的蛋白組數(shù)據(jù)，橫軸和縱軸坐標(biāo)表示了這些通路在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的富集因子，正值代表激活，負(fù)值代表抑制；圖中的點(diǎn)代表了富集的通路，不同顏色的點(diǎn)代表了不用類型的功能通路。這樣，功能通路在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的狀態(tài)清晰可對比，看到相似的功能通路在兩數(shù)據(jù)集中具有相似的激活或抑制特征。
來源文獻(xiàn)，Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets
令小編好奇的是，這個(gè)2D annotation enrichment分析是如何根據(jù)兩組數(shù)據(jù)集中蛋白水平的倍數(shù)變化，關(guān)聯(lián)到通路水平進(jìn)行比較，解釋生物學(xué)問題的呢？本篇就讓我們重現(xiàn)這種分析方法。
2D annotation enrichment可以對兩個(gè)不同的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，以對比它們的一致性與不同。例如，對蛋白組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行聯(lián)合分析，根據(jù)所有蛋白或基因表達(dá)的倍數(shù)變化值，計(jì)算對應(yīng)的通路是否受到激活或抑制。根據(jù)結(jié)果，可以用于描述哪些通路在轉(zhuǎn)錄組水平激活而翻譯水平未體現(xiàn)，或者在翻譯水平激活但轉(zhuǎn)錄水平未體現(xiàn)，以闡述轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平基因表達(dá)的生物學(xué)現(xiàn)象。或者，根據(jù)一致的通路描述二者的共性，描述功能的一致性。
目前，2D annotation enrichment可以使用Perseus軟件來完成分析，Perseus下載地址：https://www.maxquant.org/perseus/
這應(yīng)該是關(guān)于2D annotation enrichment的第一篇中文教程了。為了方便大家操作，測試數(shù)據(jù)，作圖R代碼等，可在微信公眾號閱讀原文獲取。
1 輸入數(shù)據(jù)格式
輸入數(shù)據(jù)文件以制表符分割，包含四列信息，記錄了基因名稱，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組中計(jì)算的基因的差異表達(dá)倍數(shù)，以及基因所屬的功能類別。
以該示例數(shù)據(jù)為例：
gene，基因名稱列，記錄基因的名稱，可以為任意名稱。
logFC_gene和logFC_protein，log2轉(zhuǎn)換后的差異倍數(shù)，一列是基因?qū)?yīng)的蛋白的差異表達(dá)，一列是基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)。
GO_term，基因所屬的功能條目，該示例中展示了基因歸類的GO功能類別。
由于一個(gè)基因可以歸屬多條功能，因此基因名稱或者功能條目均可以出現(xiàn)多次。
2 數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Perseus
Perseus的安裝過程就不再多說了，很簡單，下載就能用。界面也是圖形化界面，很好操作?，F(xiàn)在我們打開Perseus，將準(zhǔn)備的數(shù)據(jù)讀取到Perseus中用作功能富集分析。
軟件左上方有個(gè)導(dǎo)入按鈕，點(diǎn)擊后在新界面選擇本地的文件讀取，并設(shè)置列的類型后，點(diǎn)擊確定即可成功讀入。
3 1D annotation enrichment
接下來就是令人激動(dòng)的分析環(huán)節(jié)了，我們首先來看單組學(xué)數(shù)據(jù)集的功能分析過程吧，也就是1D annotation enrichment。
例如這里以蛋白組數(shù)據(jù)集為例，根據(jù)所有蛋白的倍數(shù)變化值，計(jì)算這些蛋白對應(yīng)的通路是否受到激活或抑制。
備注：就目前而言，1D annotation enrichment很少使用，更多地使用基因集富集分析（GSEA）實(shí)現(xiàn)類似的目的。
結(jié)果表格中，重點(diǎn)關(guān)注幾列信息就可以了。
C:Name，為富集的功能條目名稱，本示例中，為基因所屬的GO功能類別的名稱。
N:Size，富集到該功能的蛋白數(shù)量。
N:Score，富集得分，取值范圍-1~1，正值代表了該通路的激活，負(fù)值代表了該通路的抑制。
N:Pvalue和FDR，分別為通路富集的p值和p調(diào)整值，只保留了設(shè)定在閾值范圍內(nèi)的顯著結(jié)果。
對于富集結(jié)果的輸出，點(diǎn)擊右上方的保存按鈕，輸出在本地文件保存。
4 2D annotation enrichment
2D annotation enrichment分析是Perseus的特色，可以對兩個(gè)不同的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，以對比它們的一致性與不同。
接下來，我們同時(shí)選擇蛋白組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，根據(jù)所有蛋白或基因表達(dá)的倍數(shù)變化值，計(jì)算對應(yīng)的通路是否受到激活或抑制。根據(jù)結(jié)果，可以用于描述哪些通路在轉(zhuǎn)錄組水平激活而翻譯水平未體現(xiàn)，或者在翻譯水平激活但轉(zhuǎn)錄水平未體現(xiàn)，以闡述轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平基因表達(dá)的生物學(xué)現(xiàn)象?；蛘?，根據(jù)一致的通路描述二者的共性。
類似地，結(jié)果表格中，重點(diǎn)關(guān)注幾列信息就可以了。
logFC_protein和logFC_gene，分別為蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的富集得分，取值范圍-1~1，正值代表了該通路的激活，負(fù)值代表了該通路的抑制。
T:Names，為富集的功能條目名稱，本示例中，為基因所屬的GO功能類別的名稱。
N:Size，富集到該功能的基因數(shù)量。
N:Pvalue和FDR，分別為通路富集的p值和p調(diào)整值，只保留了設(shè)定在閾值范圍內(nèi)的顯著結(jié)果。
對于富集結(jié)果的輸出，點(diǎn)擊右上方的保存按鈕，輸出在本地文件保存。
5 R語言的可視化
通路的富集分析結(jié)果拿到手了，最后就是作圖展示。
結(jié)果輸出后，稍作處理，例如可以繼續(xù)為功能添加分類。對于分類的添加，可以是進(jìn)一步的功能大類，將通路關(guān)聯(lián)到更大的分類中，這樣更有利于描述功能的一致性?；蛘?，根據(jù)蛋白組和轉(zhuǎn)錄組的通路富集的一致性趨勢劃分分類也可以。這里直接按四象限分布劃分分類了，僅用作示例展示。
最后，我們使用R語言ggplot2包繪制二維散點(diǎn)圖表示通路富集，就以2D annotation enrichment 得到的蛋白組和轉(zhuǎn)錄組雙組學(xué)的聯(lián)合分析為例展示。
#2D使用Perseus計(jì)算
#并手動(dòng)添加功能分類后，在R里作圖
?
dat <- read.delim('2D_result.txt')
?
#散點(diǎn)圖
library(ggplot2)
library(ggrepel)
?
ggplot(dat, aes(logFC_protein, logFC_gene)) +
geom_point(aes(color = type), size = 2) +
theme(panel.grid.minor = element_blank(), axis.line = element_line(color = 'black')) +
geom_vline(xintercept = 0, linetype = 2) +
geom_hline(yintercept = 0, linetype = 2) +
labs(x = 'Proteome\nlog2FC', y = 'Transcriptome\nlog2FC', color = '') +
scale_x_continuous(expand = c(0, 0), limit = c(-1, 1)) +
scale_y_continuous(expand = c(0, 0), limit = c(-1, 1)) +
geom_text_repel(aes(label = Names), size = 3,
box.padding = unit(0.5, 'lines'), show.legend = FALSE)
這樣，成品圖就出來了，后續(xù)根據(jù)兩個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)富集通路的一致性或區(qū)別，描述生物學(xué)現(xiàn)象就可以了。
紀(jì)偉點(diǎn)評：我們經(jīng)常聽到多組學(xué)分析，多數(shù)據(jù)集關(guān)聯(lián)分析，這些聯(lián)合分析可以很好的說明分子及功能的變化規(guī)律的普遍性，穩(wěn)定性，但聯(lián)合分析出圖是個(gè)大問題。
分子水平差異變化：如轉(zhuǎn)錄組mRNA, lncRNA, circRNA, miRNA與蛋白，磷酸化蛋白，代謝小分子，基因突變，染色體變異等；及不同來源數(shù)據(jù)集（公共數(shù)據(jù)）分子的比較如何出圖。
功能水平上：富集重要信號通路如增殖，粘附，胰島素分泌等關(guān)心的通路如何在多組學(xué)活多數(shù)據(jù)集上展示差異及共性，如何出圖。
信號軸上：某個(gè)具體的信號軸上，多組學(xué)的分子，不同的數(shù)據(jù)集如何展示其差異與共性，揭示處理?xiàng)l件下特有的信號軸變化，如何出圖。
本篇文章中的分析，給我們解決功能富集關(guān)聯(lián)提出了一個(gè)很好的方法，首次看到它時(shí)，著實(shí)讓我興奮不已，此刻依然心潮澎湃...
