文獻(xiàn)分享--Castleman病的空間與單細(xì)胞圖譜解析關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞類型及細(xì)胞因子通路

作者，Evil Genius

NC這種級(jí)別的文章，大佬覺得是水刊，一般課題組又高不可攀。

對(duì)于90%以上的研究者，有一篇NC真的算牛了。

今天我們分享文獻(xiàn)

知識(shí)積累

為闡明Castleman?。–D）的細(xì)胞與分子機(jī)制，我們通過發(fā)現(xiàn)隊(duì)列（n=9例）和驗(yàn)證隊(duì)列（n=13例）對(duì)單中心型CD、特發(fā)性多中心型CD、HHV8相關(guān)MCD及反應(yīng)性淋巴結(jié)進(jìn)行了空間蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析。

核心發(fā)現(xiàn)

基質(zhì)細(xì)胞特征
CD病灶中顯著增多的基質(zhì)細(xì)胞形成獨(dú)特微環(huán)境，活化的濾泡樹突狀細(xì)胞（FDC）胞質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與套區(qū)B細(xì)胞的相互作用驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞活化與分化。
關(guān)鍵細(xì)胞亞群

? CXCL13+ FDC、PDGFRA+ T區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞（TRC）及ACTA2陽性血管周網(wǎng)狀細(xì)胞（PRC）是VEGF高表達(dá)與IL-6信號(hào)傳導(dǎo)的主要來源
? MCD以TRC增多為特征，UCD則表現(xiàn)為B網(wǎng)狀細(xì)胞（BRC）增加
? FDC來源的VEGF與濾泡周圍新生血管形成密切相關(guān)

信號(hào)通路機(jī)制
CD病灶中的FDC、TRC和PRC通過特異性配體-受體相互作用激活JAK-STAT、TGFβ和MAPK信號(hào)通路。
基質(zhì)細(xì)胞活化及其介導(dǎo)的B細(xì)胞激活分化、新生血管形成與基質(zhì)重塑是Castleman病的核心病理基礎(chǔ)。

整合單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組/轉(zhuǎn)錄組測序、DNA測序及拷貝數(shù)分析技術(shù)。

數(shù)據(jù)隊(duì)列

結(jié)果1、細(xì)胞組成與空間分布

通過對(duì)645,285個(gè)RLN單細(xì)胞、1,768,327個(gè)UCD細(xì)胞及2,071,397個(gè)MCD淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行免疫表型與空間分布分析，發(fā)現(xiàn)以下關(guān)鍵特征：
細(xì)胞群體差異

基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)：所有組別均可見CD20+B細(xì)胞濾泡，其間分布CD3+T細(xì)胞、CD11b+髓系單核細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞、CD31/34+內(nèi)皮細(xì)胞及CD45陰性DAPI+基質(zhì)細(xì)胞（圖1A）
RLN特征：以淋巴細(xì)胞（B/T細(xì)胞）為主，非淋巴細(xì)胞占比極低

MCD vs RLN（置換檢驗(yàn)q<0.01且|log2FC|>0.53）：

顯著增加：內(nèi)皮細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞
顯著減少：B細(xì)胞
共同變化：UCD與MCD均顯示濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和經(jīng)典樹突狀細(xì)胞（cDC）減少

突出表現(xiàn)：

MCD1中非淋巴細(xì)胞占比超25%
MCD3以非淋巴細(xì)胞為主要成分

FDC網(wǎng)絡(luò)異常

數(shù)量特征：UCD/MCD生發(fā)中心的CD45陰性DAPI+基質(zhì)核（符合FDC特征）較RLN顯著增多

功能結(jié)構(gòu)：
  • FDC通過補(bǔ)體受體CD21（CR2）/CD35（CR1）向B細(xì)胞提呈抗原，其胞質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)B細(xì)胞親和力成熟至關(guān)重要
  • CD21染色顯示：FDC網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞同心層交錯(cuò)形成緊密互作，構(gòu)成CD特征性的"洋蔥皮"樣套區(qū)結(jié)構(gòu)
定量分析：
  • 雖CD濾泡體積≤RLN，但CD21信號(hào)面積、亮度及圖像熵（復(fù)雜度指標(biāo)）在UCD/MCD中更高
  • UCD濾泡內(nèi)細(xì)胞香農(nóng)多樣性指數(shù)較低，與FDC核優(yōu)勢分布一致
病理機(jī)制提示
  • 上述發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)DC與其他基質(zhì)細(xì)胞的異?；罨?增殖可能是CD的核心發(fā)病基礎(chǔ)。

CD的微環(huán)境特征與細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)

微環(huán)境異質(zhì)性分析
通過對(duì)RLN、UCD及MCD樣本的空間聯(lián)合分析，鑒定了12種特征性微環(huán)境：
基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)：
  • B細(xì)胞生發(fā)中心
  • CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞富集的濾泡間區(qū)（與正常淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)一致）
CD特異性微環(huán)境：
  • 巨噬細(xì)胞活化微環(huán)境：所有CD樣本均出現(xiàn)濾泡間巨噬細(xì)胞富集區(qū)
  • 血管重塑相關(guān)：
    ? MCD普遍存在兩種內(nèi)皮主導(dǎo)微環(huán)境（濾泡周與濾泡間）
    ? 漿細(xì)胞富集區(qū)見于所有MCD樣本
  • 亞型特異性分布：
    ? UCD1/2和MCD1：獨(dú)特濾泡周內(nèi)皮區(qū)與漿樣樹突細(xì)胞（pDC）區(qū)
    ? MCD3/4：以濾泡間內(nèi)皮/漿細(xì)胞微環(huán)境為主
    ? MCD1：特殊套區(qū)微環(huán)境
    ? MCD1/4：出現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞富集的B細(xì)胞濾泡
細(xì)胞互作模式解析
  • 距離分析：
    ? 采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)比較各樣本細(xì)胞間距離分布與RLN差異
    ? 設(shè)定<50μm為生物學(xué)相關(guān)互作閾值
  • 關(guān)鍵異常互作：
    ? UCD/MCD顯著改變：漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與其他細(xì)胞類型的互作網(wǎng)絡(luò)
    ? 病理意義：非淋巴細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的異?？臻g鄰近可能驅(qū)動(dòng)CD發(fā)病
機(jī)制假說

研究提示：CD的特異性微環(huán)境通過重構(gòu)基質(zhì)-免疫細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)，破壞正常淋巴結(jié)功能架構(gòu)。這種由局部細(xì)胞空間鄰近性驅(qū)動(dòng)的異?；プ鳎赡苁荂D發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。


結(jié)果2、CD擴(kuò)增細(xì)胞群體的功能特征解析

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)雖能精確定量CD主要細(xì)胞類型和微環(huán)境，但對(duì)細(xì)胞功能解析有限。為此，聯(lián)合開展單核RNA測序（snRNA-seq）。
細(xì)胞群體動(dòng)態(tài)變化
譜系鑒定：成功區(qū)分B細(xì)胞、漿細(xì)胞、T細(xì)胞、髓系單核細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等群體
數(shù)量差異：
  • RLN特征：生發(fā)中心B細(xì)胞核占主導(dǎo)
  • UCD特異性：漿樣樹突細(xì)胞（pDC）、漿細(xì)胞和初始B細(xì)胞顯著增加（q<0.01，|log2FC|>0.53）
  • MCD特征：
    ? 漿細(xì)胞/增殖性漿母細(xì)胞
    ? 內(nèi)皮細(xì)胞/淋巴管內(nèi)皮
    ? 成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞（FRC）
    ? 單核/巨噬細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞
技術(shù)一致性：盡管轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中非淋巴細(xì)胞群體可能因解離偏差存在低估，但其擴(kuò)增趨勢與蛋白質(zhì)組結(jié)果高度吻合
功能通路激活圖譜
通過差異基因表達(dá)與通路富集分析，揭示關(guān)鍵病理機(jī)制：
基質(zhì)細(xì)胞異?；罨?/h6>
  • FDC：胞質(zhì)突起形成和血管生成通路激活
  • FRC：VEGF、血管生成、MAPK和JAK-STAT通路顯著上調(diào)（p<0.05）
  • 共同特征：細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)通路普遍增強(qiáng)
免疫細(xì)胞功能失調(diào)：
  • 巨噬細(xì)胞：炎癥相關(guān)通路富集
  • 記憶T細(xì)胞：CCL19/21結(jié)合、B細(xì)胞活化與增殖通路激活
  • B細(xì)胞：IL-6通路介導(dǎo)的漿細(xì)胞分化
  • 漿細(xì)胞：抗體產(chǎn)生通路增強(qiáng)
病理機(jī)制整合
研究結(jié)果表明：CD的發(fā)病涉及多細(xì)胞群體協(xié)同作用，包括基質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的血管生成/基質(zhì)重塑、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、T細(xì)胞活化以及IL-6依賴的B細(xì)胞-漿細(xì)胞分化。這些生理性免疫應(yīng)答過程在CD中呈現(xiàn)病理性亢進(jìn)狀態(tài)。

基質(zhì)細(xì)胞亞群與關(guān)鍵細(xì)胞因子的起源

基質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性解析
基于CD中關(guān)鍵通路在基質(zhì)細(xì)胞的顯著富集，對(duì)其進(jìn)行了深度分析：
分群策略：
  • 提取所有樣本中非造血細(xì)胞的單核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
  • 通過基質(zhì)特異性標(biāo)記物進(jìn)行注釋
亞群特征：
  • 內(nèi)皮細(xì)胞：
    ? CDH5+ENG+血液內(nèi)皮細(xì)胞（BECs）
    ? PROX1+淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LECs）（在MCD中顯著增多）
  • 間質(zhì)細(xì)胞：
    ? ACTA2+血管周網(wǎng)狀細(xì)胞（PRCs）
    ? PDGFRA/B+CCL21highCCL19lowCXCL12+T區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞（TRCs）（MCD優(yōu)勢群體）
  • 濾泡區(qū)細(xì)胞：
    ? CXCL13+濾泡樹突細(xì)胞（FDCs）
    ? FDCSP+CLU+B區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞（BRCs）（UCD主要群體）
細(xì)胞因子溯源分析

針對(duì)CD特征性升高的循環(huán)VEGF和IL-6，我們進(jìn)行了細(xì)胞來源定位：

VEGF表達(dá)譜：
  • 主要來源：PRCs和TRCs（所有MCD樣本中特異性高表達(dá)）
  • 次要來源：FDCs（UCD1、MCD1和MCD3中表達(dá)）
IL-6相關(guān)基因模塊：
  • 高表達(dá)群體：
    ? MCD的PRC和CRC
    ? UCD的FDCs
核心發(fā)現(xiàn)：基質(zhì)細(xì)胞是CD關(guān)鍵細(xì)胞因子的主要生產(chǎn)者

結(jié)果3、VEGF與IL-6表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞的空間定位

采用高靈敏度多重核酸原位雜交技術(shù)（RNAscope），對(duì)以下靶點(diǎn)進(jìn)行共定位分析：
  • 細(xì)胞因子：VEGFA、IL-6
  • 細(xì)胞標(biāo)記物：CD19（B細(xì)胞）、CXCL12/CXCL13（趨化因子）、PDGFRA（TRC）、ACTA2（PRC）
VEGF表達(dá)模式
總體特征：
  • UCD與MCD均顯示高VEGFA表達(dá)，但分布模式迥異
  • UCD：表達(dá)局限于濾泡區(qū)
  • MCD：濾泡與濾泡間區(qū)均顯著高表達(dá)
細(xì)胞特異性定位：
  • 濾泡內(nèi)：
    ? 與CXCL13+胞質(zhì)共定位 → 明確為FDC來源
    ? 特征性表現(xiàn)為FDC核內(nèi)強(qiáng)信號(hào)
  • 濾泡間區(qū)：
    ? 與PDGFRA+基質(zhì)細(xì)胞共定位 → 符合TRC特征
    ? 與ACTA2+PRC共表達(dá) → 血管周定位明確
IL-6表達(dá)特征
  • 優(yōu)勢樣本：MCD3/4呈現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)
  • 共表達(dá)模式：
    MCD3：IL-6/VEGF/PDGFR三重共表達(dá)
    MCD4：
    ? IL-6/PDGFR共表達(dá)
    ? IL-6+CD19+免疫母細(xì)胞
    ? IL-6+ACTA2+PRC

轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的整合分析

技術(shù)整合策略
技術(shù)挑戰(zhàn)：
  • 單核RNA測序（snRNA-seq）鑒定了多個(gè)基質(zhì)細(xì)胞亞群
  • CODEX蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)因缺乏特異性表面標(biāo)記而難以精確區(qū)分這些亞群
解決方案：
  • 采用MaxFuse算法整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)
  • 實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵基質(zhì)亞群在生發(fā)中心濾泡及其周圍的空間定位
基質(zhì)細(xì)胞空間分布特征
濾泡樹突細(xì)胞（FDC）：

精確定位于CD21陽性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中心
在UCD和MCD中數(shù)量顯著增加

B區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞（BRC）：

分布于RLN和UCD的濾泡內(nèi)

血管周網(wǎng)狀細(xì)胞（PRC）：

定位于血管壁
與血液內(nèi)皮細(xì)胞（BEC）和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）明顯不同

生發(fā)中心濾泡的精細(xì)解析
分析方法：

通過細(xì)胞微環(huán)境分析識(shí)別濾泡結(jié)構(gòu)
采用100像素同心圓分層法

細(xì)胞分布模式：

B細(xì)胞：富集于濾泡區(qū)
CD4+T細(xì)胞：主要分布在濾泡周圍區(qū)

血液內(nèi)皮細(xì)胞（BEC）：

? 在濾泡周圍區(qū)形成分布高峰
? 與基質(zhì)細(xì)胞分布峰值相鄰（MCD中尤為顯著）

病理意義：

內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)基質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF的趨化作用
解釋了CD特征性的"棒棒糖"樣穿透血管結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制

技術(shù)突破與發(fā)現(xiàn)
方法學(xué)創(chuàng)新：

首次實(shí)現(xiàn)snRNA-seq細(xì)胞分群結(jié)果向多重成像數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)映射
通過計(jì)算輪廓分層量化細(xì)胞亞群的空間分布

關(guān)鍵結(jié)論：
揭示了基質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞空間共定位的分子基礎(chǔ)
為CD特征性血管改變提供了細(xì)胞層面的解釋

結(jié)果4、基質(zhì)細(xì)胞的配體-受體互作特征

基于單核RNA測序數(shù)據(jù)，通過LIANA算法聯(lián)合Tensor-cell2cell分析平臺(tái)，系統(tǒng)鑒定了驅(qū)動(dòng)UCD和MCD的關(guān)鍵配體-受體互作網(wǎng)絡(luò)。
疾病特異性互作模式
1. UCD特征性互作

核心通路激活：JAK-STAT、TGFβ和MAPK信號(hào)通路

主要互作類型：

膠原-整合素介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）互作
補(bǔ)體系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)互作
PRC與巨噬細(xì)胞間的VEGF信號(hào)互作

亞型聚類：UCD1/2與MCD1/2共享部分特征因子，UCD3則與MCD3/4聚類
  1. MCD特征性互作
    核心通路激活：JAK-STAT、TGFβ、MAPK及TNF通路
細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征：

TRC通過膠原/SDC1（CD138）與漿細(xì)胞互作
TRC分泌VEGF與BEC表面受體結(jié)合
PRC與BEC/LEC的血管重塑相關(guān)互作（MCD4顯著）

治療靶點(diǎn)啟示
研究發(fā)現(xiàn)：

基質(zhì)細(xì)胞-免疫細(xì)胞軸：TRC/PRC通過VEGF-受體互作驅(qū)動(dòng)血管異常增生
基質(zhì)-漿細(xì)胞對(duì)話：膠原/SDC1介導(dǎo)的互作可能促進(jìn)漿細(xì)胞存活

轉(zhuǎn)化意義：靶向關(guān)鍵配體-受體對(duì)可望緩解MCD癥狀。

結(jié)果5、驗(yàn)證隊(duì)列的空間轉(zhuǎn)錄組分析

對(duì)13例CD病例及對(duì)照（驗(yàn)證隊(duì)列）進(jìn)行了10x Xenium空間轉(zhuǎn)錄組分析。

結(jié)果6、DNA測序、免疫組庫與病毒序列分析結(jié)果

基因組變異特征

臨床級(jí)測序分析：
  • 未檢出具有臨床意義的Tier 1/2級(jí)單核苷酸變異或拷貝數(shù)變異
  • 發(fā)現(xiàn)意義未明的Tier 3級(jí)變異：
    ? UCD1/3和MCD1/4存在高變異等位基因頻率（VAF）變異
    ? 提示可能存在種系變異
既往報(bào)道變體重分析：
  • 檢測到極低頻率變異（2-5/1000 reads）：
    ? PDGFRB p.N666S（UCD2）
    ? ALK p.R292H（UCD2/3，MCD1/3）
    ? BCOR p.G1289D（UCD3）
檢出率接近Illumina測序錯(cuò)誤率（1/1000），臨床意義不確定
免疫組庫分析
方法學(xué)：5′端測序分析T/B細(xì)胞受體
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：

共鑒定1,631個(gè)單核TCR和6,556個(gè)單核BCR序列
未發(fā)現(xiàn)克隆性限制性B/T細(xì)胞群體

  • 漿細(xì)胞特征：
    ? UCD3和MCD3/4的漿細(xì)胞呈現(xiàn)高頻體細(xì)胞超突變
    ? 主要類別轉(zhuǎn)換為IgG1（附圖6A-B）
    ? 提示濾泡網(wǎng)狀細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的生發(fā)中心過程
病毒關(guān)聯(lián)分析
檢測策略：比對(duì)HHV8/HIV/EBV參考基因組
陽性結(jié)果：

僅在MCD4（HIV感染者）中檢出HHV8序列
病毒序列主要富集于漿細(xì)胞

陰性結(jié)果：其他UCD/MCD/RLN樣本均未檢出HHV8/EBV/HIV
核心結(jié)論
本研究證實(shí)：濾泡網(wǎng)狀細(xì)胞的活化與增殖通過分泌VEGF和IL-6，驅(qū)動(dòng)了所有CD亞型共有的病理過程，包括：
  • B細(xì)胞激活與漿細(xì)胞分化
  • 病理性血管新生

  • 基質(zhì)重塑


最后來看看方法

單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析

配受體分析

DNA分析

Xenium數(shù)據(jù)分析

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