網(wǎng)絡(luò)：其實就是“圖”，由點（node）和邊（edge）組成
一般來講，探索基因表達數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)流程是這樣：

差異表達分析: 研究轉(zhuǎn)錄水平不同處理的差別的原因
基因富集分析 (GO/KEGG)。得到差異基因，需要注釋一下，但只能兩兩比較（如：實驗與對照），然后得到的結(jié)果也只是知道哪些上調(diào)哪些下調(diào)，是一個宏觀的結(jié)論
生物網(wǎng)絡(luò)分析:
- 蛋白互作（PPI）:表示蛋白之間物理聯(lián)系，它們幾乎占據(jù)了細(xì)胞生物過程的中心位置。蛋白作為點，用無向的線連接
- 代謝網(wǎng)絡(luò): 主要表示生化反應(yīng)，有助于生物生長、繁殖、維持結(jié)構(gòu)。點是代謝產(chǎn)物，并用有向的箭頭表示代謝過程或特定反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用
- 基因互作: 不同的點表示不同基因，描述它們功能相關(guān)性；可以根據(jù)基因的背景知識來推斷線的方向
- 基因/轉(zhuǎn)錄調(diào)控: 表示基因表達是如何被調(diào)控的；點是基因或轉(zhuǎn)錄因子，它們之間的關(guān)系也是定向，例如Reactome、KEGG等數(shù)據(jù)庫中表示基因調(diào)節(jié)的關(guān)系
- 細(xì)胞信號：點表示通路中的物質(zhì)，如蛋白、核酸或其他代謝物

一、GO+KEGG分析功能注釋

找出差異基因下一步進行功能富集分析

方案1：DAVID網(wǎng)站

進入 https://david.ncifcrf.gov/
-點擊“Functional Annotation”輸入不超過3000個基因的gene list；輸入格式是每行一個基因名或者基因名用逗號隔開。
選擇"OFFICIAL_GENE_SYMBOL"
選擇"Gene list"
點擊提交
點擊“Gene_Ontology”進行GO分析，對基因進行功能注釋，勾選GO分析的三個參數(shù)：BP（生物學(xué)過程），CC（細(xì)胞組分），MF（分子功能）。
找到“Pathways”,選擇KEGG_PATHWAY
點擊 Chart
點擊其中一條通路的Term，查看通路圖。

方案2：Metascape網(wǎng)站（網(wǎng)站更新較快）

進入http://metascape.org/
輸入基因，有兩種方式，本地文件導(dǎo)入或者粘貼gene list，支持xls/xlsx，CSV，txt三種格式。
選擇物種
選擇“Express Analyze”或“Custom Analyze”進行分析
點擊提交
點擊“Express Analyze”查看結(jié)果
- Figure 1 : 功能富集分析的結(jié)果圖
- Table 1: TOP20的聚類分析表
- Figure 2: 富集網(wǎng)絡(luò)圖，左側(cè)是根據(jù)gene ID進行的聚類，右側(cè)是根據(jù)P-Value進行的聚類
- Figure 3 : PPI聚類功能模塊分析圖。

二、蛋白互作（PPI）分析

表示蛋白之間物理聯(lián)系，它們幾乎占據(jù)了細(xì)胞生物過程的中心位置。蛋白作為點，用無向的線連接

分析方案：STRING網(wǎng)站+Cytoscape軟件制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI分析)

進入STRING網(wǎng)站的官網(wǎng)： https://string-db.org/
通常選擇輸入方式是“Multiple proteins”
然后輸入不超過2000個基因的差異基因名，每行一個基因
選擇物種類型
點擊“SEARCH”，繼續(xù)點擊“CONTINUE”
下拉當(dāng)前頁面，菜單欄的Legend選項卡里面是關(guān)于網(wǎng)絡(luò)圖中Nodes和Edges的注釋
- 菜單欄的Settings選項卡可以對Edges進行調(diào)整。
- “confidence”是通過線條的粗細(xì)來反映蛋白之間相互作用的強弱。
- 如果網(wǎng)絡(luò)圖比較分散，可以設(shè)置“minimum required interaction score”將conbined_score調(diào)高，使圖形看上去更緊密。
- 可以通過設(shè)置蛋白數(shù)量的上限，比如我們將其設(shè)置為“no more than 50 interactors”改變網(wǎng)絡(luò)圖上的蛋白數(shù)量
- 菜單欄的Analysis選項卡里面，可以查看network的一些信息，包括nodes、edges、degree、PPI富集分?jǐn)?shù)的P值等，同時也能查看GO和KEGG功能富集信息及其他信息
- Clusters選項卡，是將PPI網(wǎng)絡(luò)進行聚類，點擊APPLY。通過聚類后，蛋白通過聚類形成不同顏色的成簇分布的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

直接點擊“Exports”選項，下載TSV格式的文件保存，得到一張PPI圖

利用網(wǎng)絡(luò)聚類算法可以從復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中挖掘蛋白復(fù)合體或者相應(yīng)的功能模塊，其中MCODE算法是最常用的挖掘蛋白復(fù)合體的算法。MCODE全稱molecular complex detection, 是最廣泛使用的挖掘蛋白復(fù)合體的算法之一，在cytoscape 軟件中提供了一個MCODE插件，可以方便的對網(wǎng)絡(luò)進行聚類。

cytoscape 是一個功能強大的網(wǎng)絡(luò)可視化軟件，除了基本的可視化之外，通過各種插件，還可以輕松的實現(xiàn)各種數(shù)據(jù)分析，插件的下載地址: http://apps.cytoscape.org/

打開Cytoscape軟件，File-->Import -->Network-->file, 然后選擇對應(yīng)的TSV格式的文件，對PPI圖進一步美化
依次點擊Tools-->NetworkAnalyzer-->Network Analysis-->Generate style from statistics
在彈窗中操作：在Cytoscape軟件中Node的大小和漸變顏色由Degree來調(diào)整，Edge的粗細(xì)和漸變顏色由combined_score來調(diào)整。
點擊“Apply”
若要制作以某個蛋白為中心的PPI：例如選擇IL10蛋白作為中心蛋白，首先點擊該蛋白。依次點擊File-->New-->Network-->From selected nodes,all edges。形成一張以IL10為中心的局部PPI網(wǎng)絡(luò)。
使用MCODE插件，Apps-->MCODE, 啟動MCODE插件，在控制面板，選擇默認(rèn)參數(shù)，對整個網(wǎng)絡(luò)繼續(xù)聚類
聚類之后會得到多個子網(wǎng)subnetwork, 對于每個子網(wǎng)，可以看到其節(jié)點數(shù)，邊數(shù)，打分值等基本信息，通過MCODE插件，可以方便的得到復(fù)雜的PPI網(wǎng)絡(luò)中潛在的各個子網(wǎng)，但是后續(xù)還是要結(jié)合功能注釋，比如KEGG，蛋白復(fù)合物數(shù)據(jù)庫的注釋等，對結(jié)果進一步解讀。

三、通過WGCNA構(gòu)建的基因共表達網(wǎng)絡(luò)

生信寶典：WGCNA分析，簡單全面的最新教程

WGCNA基本概念：
- 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA, Weighted correlation network
  analysis)是用來描述不同樣品之間基因關(guān)聯(lián)模式的系統(tǒng)生物學(xué)方法，可以用來鑒定高度協(xié)同變化的基因集,
  并根據(jù)基因集的內(nèi)連性和基因集與表型之間的關(guān)聯(lián)鑒定候補生物標(biāo)記基因或治療靶點。
- WGCNA利用數(shù)千或近萬個變化最大的基因或全部基因的信息識別感興趣的基因集，并與表型進行顯著性關(guān)聯(lián)分析。一是充分利用了信息，二是把數(shù)千個基因與表型的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)換為數(shù)個基因集與表型的關(guān)聯(lián)，免去了多重假設(shè)檢驗校正的問題。
- 共表達網(wǎng)絡(luò)：定義為加權(quán)基因網(wǎng)絡(luò)。點代表基因，邊代表基因表達相關(guān)性。加權(quán)是指對相關(guān)性值進行冥次運算
- Module(模塊)：高度內(nèi)連的基因集。
- Connectivity (連接度)：類似于網(wǎng)絡(luò)中 "度"
  (degree)的概念。每個基因的連接度是與其相連的基因的邊屬性之和。
- Module eigengene E: 給定模型的第一主成分，代表整個模型的基因表達譜。
- Intramodular connectivity: 給定基因與給定模型內(nèi)其他基因的關(guān)聯(lián)度，判斷基因所屬關(guān)系。
Module membershi）: 給定基因表達譜與給定模型的eigengene的相關(guān)性。
Hub gene : 關(guān)鍵基因 (連接度最多或連接多個模塊的基因)。
Adjacency matrix： (鄰接矩陣)：基因和基因之間的加權(quán)相關(guān)性值構(gòu)成的矩陣。
TOM (Topological overlap
matrix)：把鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣，以降低噪音和假相關(guān)，獲得的新距離矩陣，這個信息可拿來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)或繪制TOM圖。

分析流程：

數(shù)據(jù)導(dǎo)入，數(shù)據(jù)篩選，軟閾值篩選（軟閾值的篩選原則是使構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)更符合無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)特征）
構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)：使用加權(quán)的表達相關(guān)性。

net = blockwiseModules(dataExpr, power = power, maxBlockSize = nGenes,
                       TOMType = type, minModuleSize = 30,
                       reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
                       numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
                       saveTOMs=TRUE, corType = corType, 
                       maxPOutliers=maxPOutliers, loadTOMs=TRUE,
                       saveTOMFileBase = paste0(exprMat, ".tom"),
                       verbose = 3)

識別基因集，展示各個模塊：基于加權(quán)相關(guān)性，進行層級聚類分析，并根據(jù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)切分聚類結(jié)果，獲得不同的基因模塊，用聚類樹的分枝和不同顏色表示

繪制模塊之間相關(guān)性圖：如果有表型信息，計算基因模塊與表型的相關(guān)性，鑒定性狀相關(guān)的模塊。
研究模型之間的關(guān)系，從系統(tǒng)層面查看不同模型的互作網(wǎng)絡(luò)。
從關(guān)鍵模型中選擇感興趣的驅(qū)動基因，或根據(jù)模型中已知基因的功能推測未知基因的功能。
可視化基因網(wǎng)絡(luò) (TOM plot): 導(dǎo)出TOM矩陣，繪制相關(guān)性圖。
導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)用于Cytoscape
關(guān)聯(lián)表型數(shù)據(jù)

四、數(shù)據(jù)庫

4.1 chipBase:轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)

chipBase收集來自GEO,ENCODE數(shù)據(jù)庫中的chip_seq數(shù)據(jù)，通過對這些原始數(shù)據(jù)進行分析，致力于構(gòu)建各種轉(zhuǎn)錄因子與非編碼RNA, 蛋白編碼基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的流程
該數(shù)據(jù)庫將基因分成了以下幾類
- LncRNA
- miRNA
- Other NcRNA
- Protein
功能：
1. 查看轉(zhuǎn)錄因子和基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò): 首先確定感興趣的轉(zhuǎn)錄因子，然后選擇對應(yīng)的數(shù)據(jù)集，再選擇靶基因篩選的范圍，最終確定轉(zhuǎn)錄因子潛在的靶基因
2. Regulator: 輸入感興趣的基因，查看有哪些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控該基因，點擊factor可以查看對應(yīng)的詳細(xì)結(jié)果，示意如下
3. Chip-Function: 對靶基因進行GO富集分析
4. Co-Expression: 分析轉(zhuǎn)錄因子和基因表達量的相關(guān)性

通過chip_base, 可以方便的查看轉(zhuǎn)錄因子與基因間的調(diào)控關(guān)系，還可以進一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組的共表達分析對結(jié)果進行篩選。

4.2 Co-LncRNA:lncRNA與蛋白編碼基因的共表達網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫

Co-LncRNA通過分析查找與lncRNA共表達的mRNA,構(gòu)建lncRNA與mRNA之間的共表達網(wǎng)絡(luò)，并通過共表達的mRNA對應(yīng)的GO和KEGG來研究lncRNA的功能。

通過CEGsFuncs查看lncRNA的共表達mRNA的功能富集結(jié)果
選擇數(shù)據(jù)集和共表達分析的方法，設(shè)置閾值，通過mRNA或者lncRNA的名字來查找對應(yīng)的共表達基因，點擊pattern可以查看詳細(xì)的分析結(jié)果
通過CEGsFuncs查看lncRNA的共表達mRNA的功能富集結(jié)果，示意如下
對于KEGG富集的結(jié)果，點擊可以查看具體的通路圖，在通路圖上，會將共表達的蛋白編碼基因用紅色標(biāo)記
通過CEGsNet, 可以查看lncRNA與mRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)

五、LncRNA等RNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.1 LncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)

??很多文獻和數(shù)據(jù)庫中都有報道的lncRNA與mRNA之間相互作用，也可以通過軟件來預(yù)測二者之間的結(jié)合，通過lncRNA的靶標(biāo)mRNA, 來研究lncRNA的功能。通常認(rèn)為共表達基因集參與同一通路，或者受到同樣的調(diào)控，具有相似的生物學(xué)功能，利用表達譜數(shù)據(jù)尋找與lncRNA共表達的mRNA,從而來研究

做lncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)步驟：

用三列計算皮爾森相關(guān)系數(shù)

第一列：樣本號。

第二列：lncR的表達量。

第三列：mRNA的表達量。

篩選顯著結(jié)果
然后用cytoscape畫圖
研究lncRNA的功能。

5.2 LncRNA與miRNA共表達網(wǎng)絡(luò)

??長非編碼RNAs（lncRNAs）和小分子RNA（miRNAs）的代表兩類重要的非編碼RNA在真核生物。雖然這些非編碼RNA與有機體的生長和人類多種疾病有著密切的關(guān)系，但很少有人知道他們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。新一代DNA測序技術(shù)（ChIP-SEQ）染色質(zhì)免疫沉淀的最新進展提供了前所未有的靈敏度與檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位（TFBSs）的方法。

miRNA與lncRNA的關(guān)系通過DIANA-LncBase數(shù)據(jù)庫中獲取

5.3 mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建mRNA-miRNA-lncRNA的三元ceRNA網(wǎng)絡(luò)

5.4 LncRNA-TF-Gene網(wǎng)絡(luò)通路的構(gòu)建

在線的構(gòu)建LncRNA-TF-Gene網(wǎng)絡(luò)工具-LncMAP。此工具通過整合基因組廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與配對的lncRNA和基因表達譜，顯示轉(zhuǎn)錄與其調(diào)節(jié)的靶基因以及l(fā)ncRNA網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。對揭示人類癌癥生物學(xué)機制有重要意義。

參考文章：

基于RNA-seq的共表達網(wǎng)絡(luò)分析工具
STRING網(wǎng)站 Cytoscape軟件制作精美蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)
PPI網(wǎng)絡(luò)實戰(zhàn)：String加CytoScape聯(lián)手挖掘PPI網(wǎng)絡(luò)
WGCNA分析，簡單全面的最新教程
RNA-seq數(shù)據(jù)的基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析
chipBase:轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)
Co-LncRNA:lncRNA與蛋白編碼基因的共表達網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫
科研時間：LncRNA-TF-Gene網(wǎng)絡(luò)通路的構(gòu)建
miRNA與lncRNA的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

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【轉(zhuǎn)載整合】RNAseq data的network analysis的不同做法，原理和方案

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一、GO+KEGG分析功能注釋

方案1：DAVID網(wǎng)站

方案2：Metascape網(wǎng)站（網(wǎng)站更新較快）

二、蛋白互作（PPI）分析

分析方案：STRING網(wǎng)站+Cytoscape軟件制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI分析)

三、通過WGCNA構(gòu)建的基因共表達網(wǎng)絡(luò)

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四、數(shù)據(jù)庫

4.1 chipBase:轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)

4.2 Co-LncRNA:lncRNA與蛋白編碼基因的共表達網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫

五、LncRNA等RNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.1 LncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.2 LncRNA與miRNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.3 mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)圖

5.4 LncRNA-TF-Gene網(wǎng)絡(luò)通路的構(gòu)建

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一、GO+KEGG分析功能注釋

方案1：DAVID網(wǎng)站

方案2：Metascape網(wǎng)站（網(wǎng)站更新較快）

二、蛋白互作（PPI）分析

分析方案：STRING網(wǎng)站+Cytoscape軟件制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI分析)

三、通過WGCNA構(gòu)建的基因共表達網(wǎng)絡(luò)

分析流程：

四、數(shù)據(jù)庫

4.1 chipBase:轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)

4.2 Co-LncRNA:lncRNA與蛋白編碼基因的共表達網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫

五、LncRNA等RNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.1 LncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.2 LncRNA與miRNA共表達網(wǎng)絡(luò)

5.3 mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)圖

5.4 LncRNA-TF-Gene網(wǎng)絡(luò)通路的構(gòu)建

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一、GO+KEGG分析功能注釋

二、蛋白互作（PPI）分析

三、通過WGCNA構(gòu)建的基因共表達網(wǎng)絡(luò)

四、數(shù)據(jù)庫

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