今天介紹空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的第一篇文章，來(lái)自瑞典卡羅林斯卡研究機(jī)構(gòu)的開(kāi)發(fā)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，這開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)很好的模式，為后邊時(shí)空組學(xué)的發(fā)展帶來(lái)了啟示，為醫(yī)學(xué)影像革命具有重要推動(dòng)作用。

組織切片中蛋白質(zhì)或信使rna (mRNAs)的模式分析是生物醫(yī)學(xué)研究和診斷的基石。這通常涉及到一次顯示幾個(gè)蛋白質(zhì)或表達(dá)基因。我們已經(jīng)設(shè)計(jì)了一個(gè)策略，我們稱之為空間轉(zhuǎn)錄組，它允許可視化和定量分析的轉(zhuǎn)錄組與空間分辨率在單個(gè)組織切片。通過(guò)在排列的逆轉(zhuǎn)錄引物上使用獨(dú)特的條形碼定位組織學(xué)切片，我們展示了高質(zhì)量的rna測(cè)序數(shù)據(jù)，并保留了來(lái)自小鼠大腦和人類乳腺癌的二維位置信息?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了定量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和組織切片中mRNA的可視化分布，使新型的生物信息學(xué)分析成為可能，對(duì)研究和診斷有價(jià)值。

組織轉(zhuǎn)錄組通常是通過(guò)均一組織切片的RNA測(cè)序(RNA-seq)來(lái)研究的，這會(huì)導(dǎo)致平均轉(zhuǎn)錄組和空間信息的丟失?；虮磉_(dá)的位置背景對(duì)理解組織功能和病理變化至關(guān)重要。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了幾種策略與這一目標(biāo),但它們有局限性的數(shù)量記錄,可以分析,依靠豐富的現(xiàn)有數(shù)據(jù)集,和/或昂貴,勞動(dòng)密集型的,沒(méi)有一個(gè)是運(yùn)行在標(biāo)準(zhǔn)的研究和診斷的常規(guī)組織學(xué)組織部分。我們?cè)儐?wèn)是否有可能在rna測(cè)序前完整組織切片的互補(bǔ)DNA (cDNA)合成反應(yīng)中引入位置分子條形碼。我們首先評(píng)估了從表面組織切片中的信使RNA (mRNA)生成cDNA的可行性。我們將反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)引物固定在玻片上，并將其置于成年小鼠嗅球切片上，嗅球是一個(gè)具有清晰組織學(xué)標(biāo)志和豐富基因表達(dá)參考數(shù)據(jù)的腦區(qū)。組織固定、染色并成像。
在滲透后，我們?cè)诮M織的頂部添加反轉(zhuǎn)錄試劑。我們使用熒光標(biāo)記的核苷酸使合成的cDNA可視化。組織就開(kāi)始刪除,造成cDNA耦合arrayedoligonucleotides幻燈片。相對(duì)應(yīng)的熒光cDNA詳細(xì)顯示模式的組織結(jié)構(gòu)顯示一般組織學(xué)(圖1,B和C),和cDNAwas嚴(yán)格局部直屬單個(gè)細(xì)胞(圖1 D G)。通過(guò)比較hematoxylin-and-eosin和熒光信號(hào),我們可以測(cè)量的平均距離擴(kuò)散邊界外的細(xì)胞1.7 - 2毫米(SD)(圖S1, E H)。意識(shí)到可以捕獲mRNA在組織部分以最小的擴(kuò)散和維護(hù)位置表示動(dòng)機(jī)我們寡核苷酸陣列位置條形碼,我們表示這一戰(zhàn)略空間轉(zhuǎn)錄組。在1007個(gè)特征中，每個(gè)特征沉積了約2億個(gè)寡核苷酸，其直徑為100 mm2，中心到中心的距離為200mm，面積為6.2 mmx6.6 mm。捕獲和reverse-transcribingmRNA之后,我們生成的序列庫(kù)基于放大通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄。與RNA提取和數(shù)據(jù)分散在溶液中顯示~ 95%的基因發(fā)現(xiàn)的方法還發(fā)現(xiàn)與其他(圖S3C)。表面文庫(kù)和溶液中文庫(kù)之間的相關(guān)性r = 0.94，高表達(dá)或低表達(dá)的基因均能表達(dá)(圖S3D)。相鄰組織切片的表面實(shí)驗(yàn)重復(fù)顯示r = 0.97的相關(guān)性(圖S3E)。因此，與溶液方案相比，從表面排列寡核苷酸的組織合成cDNA是有效的，而且不會(huì)引入偏差(圖S3F和表S1)。我們使用空間條形碼將RNA-seq數(shù)據(jù)排序到對(duì)應(yīng)的陣列特征，并將組織圖像與陣列特征對(duì)齊，從而實(shí)現(xiàn)可視化和分析?；虮磉_(dá)模式的例子揭示了空間轉(zhuǎn)錄組和驗(yàn)證的原位雜交顯示。S4, c .轉(zhuǎn)錄表達(dá)在非常低的水平,如嗅覺(jué)受體信使rna,也被發(fā)現(xiàn)與空間轉(zhuǎn)錄組(圖S4D)。
每個(gè)個(gè)體特征的基(圖2C)和獨(dú)特轉(zhuǎn)錄本(圖S5A)在不同細(xì)胞密度的細(xì)胞層之間有所不同(圖2D和表S2)。對(duì)于絕大多數(shù)基因，變異系數(shù)隨著平均表達(dá)量的增加而減小基因和轉(zhuǎn)錄的數(shù)量至少兩倍當(dāng)使用激光捕獲顯微解剖和空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)幾乎兩次考試的許多基因原位雜交在艾倫大腦圖集。此外,我們比較空間轉(zhuǎn)錄組- 100%附近靈敏度的單分子熒光原位雜交在相鄰的組織部分。空間轉(zhuǎn)錄組的靈敏度為6.9 1.5%的單分子熒光原位雜交。相比之下，單細(xì)胞RNA測(cè)序已被報(bào)道有大約5 - 40%的敏感性。為了進(jìn)一步評(píng)估轉(zhuǎn)錄本可能的橫向擴(kuò)散，我們研究了10個(gè)高度富集表達(dá)的不同基因在中間細(xì)胞層(MCL)的表達(dá)分布。

我們?cè)儐?wèn)是否可以在鄰近的顆粒細(xì)胞層(GCL)中檢測(cè)到它們。所有這些基因被證實(shí)由空間MCL中高度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組,但他們察覺(jué)或發(fā)現(xiàn)在GCL在非常低的水平,甚至是0到5毫米的邊界特性和功能的中心50到55毫米的制程(圖2、E和F和圖S7A)。相比,此外,我們記錄之間的分布與激光捕獲顯微解剖得到的區(qū)域沒(méi)有擴(kuò)散的成績(jī)單和空間轉(zhuǎn)錄組的特性,我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明這些方法之間的區(qū)別的mRNA擴(kuò)散(S7, B和C)。組織的基因表達(dá)分析的一個(gè)共同的目標(biāo)是定義特定區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組。同源區(qū)域之間的分析顯示非常相似的表達(dá)譜(圖3,A和B，以及圖S8)，沒(méi)有差異基因表達(dá)。相比之下，不同結(jié)構(gòu)域的比較顯示了不同的基因表達(dá)譜(圖3,A和C，以及圖S8)。這包括先前已知表達(dá)受限的基因，如腎小球?qū)?GL)中的Doc2g和GCL中的Penk，以及新的層特異性基因表達(dá)譜(圖3C)。這是有價(jià)值的探索群體細(xì)胞或組織域的基因表達(dá)模式，可以確定的標(biāo)記組合?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了一種替代方法，繞過(guò)多重標(biāo)記和細(xì)胞分離。一組基因存在或不存在表達(dá)的任何組合都可以用來(lái)定義感興趣的標(biāo)記譜，以供進(jìn)一步分析。特征的選擇是基于三個(gè)神經(jīng)元間標(biāo)記基因Camk4、Th和Vip的存在和/或缺失。其中一個(gè)基因單獨(dú)表達(dá)的特征分布如圖3所示。通過(guò)對(duì)基因表達(dá)的比較，我們發(fā)現(xiàn)了這些神經(jīng)元間標(biāo)記譜定義的特異性轉(zhuǎn)錄組(圖3,E和F，以及圖S8)。為了進(jìn)一步探索嗅球內(nèi)空間定義區(qū)域的基因表達(dá)譜，我們使用主成分分析(圖S9)或t分布隨機(jī)鄰居嵌入(t-SNE)機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)降維，然后進(jìn)行層次聚類(圖4A)。當(dāng)將聚類特征放到組織圖像上時(shí)，可以明顯地看到，每個(gè)聚類特征在很大程度上都對(duì)應(yīng)于明確定義的形態(tài)層(圖4B)。然后將這些聚類相互比較，從而可以識(shí)別和可視化聚類特異性標(biāo)記基因(圖S10, A和B)。這被證明是一種有效的、無(wú)偏見(jiàn)的方法來(lái)識(shí)別感興趣的細(xì)胞層中表達(dá)豐富的基因。此外,我們調(diào)查了10部分的基因表達(dá)模式的五個(gè)動(dòng)物,以及feature-to-feature相關(guān)性在相同的位置在兩個(gè)相鄰的部分。分析常規(guī)組織學(xué)和一組標(biāo)記在癌癥診斷,盡管面板的表達(dá)基因的分析已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)入診所。我們的問(wèn)題是，為基因表達(dá)分析增加空間維度是否可以增加癌癥診斷的信息，并將空間轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用于乳腺癌活檢。在圖4中，C和D為浸潤(rùn)性導(dǎo)管腫瘤區(qū)域，以及六個(gè)獨(dú)立的導(dǎo)管原位癌區(qū)域，是在形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上確定的。

侵襲性成分的空間轉(zhuǎn)錄組分析顯示細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因高表達(dá)(圖4E)。對(duì)導(dǎo)管癌原位區(qū)域的分析顯示，這些區(qū)域之間的基因表達(dá)驚人地高度異質(zhì)性，可能反映了不同的亞克隆，與癌癥進(jìn)展有關(guān)的幾個(gè)基因表達(dá)不同。例如，KRT17和GAS6與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變有關(guān)，僅在1和5區(qū)域表達(dá)高(圖4、C至E和圖S11)。因此，空間轉(zhuǎn)錄組在活檢中顯示了意想不到的異質(zhì)性，這是常規(guī)轉(zhuǎn)錄組分析無(wú)法檢測(cè)到的，而這可能提供更詳細(xì)的預(yù)后信息。與勻漿組織的RNA-seq分析相比，空間轉(zhuǎn)錄組只需要幾個(gè)額外的步驟，因?yàn)樗峁┝丝臻g信息，能夠進(jìn)行額外級(jí)別的分析。與標(biāo)準(zhǔn)方法不同，組織的不同區(qū)域在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中以相同的反應(yīng)處理，這消除了樣本之間的技術(shù)差異?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)的一個(gè)獨(dú)特特征是，任何基因表達(dá)譜都可以被選擇來(lái)指定一個(gè)分子定義的區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步分析。最后，與將組織的不同區(qū)域進(jìn)行解剖分析相比，保留了整個(gè)切片的信息;因此，分析并不局限于最初選擇的區(qū)域。因此，個(gè)體空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)可以作為研究基因表達(dá)模式的永久資源。