目標(biāo)：這個研究的目的是通過單細(xì)胞測序探究TAC小鼠心臟巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性，尋找與心臟損傷有關(guān)的巨噬細(xì)胞亞群。
方法和結(jié)果：作者從CD45⁺的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)中選擇了所有的巨噬細(xì)胞，通過降維聚類和富集分析鑒定出了一類高度促炎的CD72^hi巨噬細(xì)胞。擬時序分析和ChIP-Seq分析發(fā)現(xiàn)Rel是誘導(dǎo)CD72^hi巨噬細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Rel KD和Rel-/-骨髓嵌合小鼠施行TAC手術(shù)后心肌損傷減輕，細(xì)胞因子和ROS水平下降，心肌細(xì)胞死亡受到抑制。而對TAC小鼠進行Rel過表達的單核細(xì)胞和CD72^hi巨噬細(xì)胞注射則加重心臟損傷。在心梗中，CD72^hi巨噬細(xì)胞也可發(fā)揮促炎和介導(dǎo)心肌損傷的作用。此外，擴心病和缺血性心肌病引起的心衰患者存在CD72^hi巨噬細(xì)胞的上調(diào)。
總結(jié)：骨髓來源的，受Rel調(diào)控的CD72^hi巨噬細(xì)胞具有促炎功能，可以引起心肌損傷。因此或許可以作為多種心血管疾病的治療靶點。

Graphical abstract里面Cardiomyocytes都拼錯了是不是過分了點？

思路總結(jié)

涉及單細(xì)胞的主要還是前兩個Fig，所以主要來看一下這個部分。

1. CD72^hi巨噬細(xì)胞和炎癥表型呈正相關(guān)。

對5只TAC鼠和5只Sham鼠的心臟的免疫細(xì)胞進行了單細(xì)胞測序，質(zhì)控得到8223(Sham)和5652(TAC)個細(xì)胞。其中絕大部分都是巨噬。

所以后續(xù)的分析是從所有細(xì)胞中提取了巨噬細(xì)胞，只對巨噬細(xì)胞進行了分析

A：再聚類得到8個細(xì)胞群。（這個圖1看起來像是沒有去除批次效應(yīng)，TAC和SHAM的細(xì)胞完全分開，感覺是作者刻意為之，以便清晰將兩組細(xì)胞區(qū)分開來。）
B：使用一個促炎基因集（包含25個促炎基因）對得到的8個群進行GSEA富集分析，cluster1 4 5和促炎基因集正相關(guān)。結(jié)合圖A可以看到cluster4和5幾乎都是TAC鼠心臟的巨噬細(xì)胞。
C：進行marker screen，篩選有意義的基因。對membrane protein sets (GO:0016020) 和cluster 4中高表達的基因取交集，得到42個基因。（不太理解為什么是這兩個取交集？為啥拋開了cluster 5呢）
D：在42個基因中，CD72對cluster4和5具有最好的區(qū)分度。
這兩個ROC曲線是用CD72來表征某種巨噬細(xì)胞，但是分群的時候，想要計算ROC的細(xì)胞群比如cluster4和5中有些細(xì)胞表達CD72，有些不表達，就是說有分錯的時候。這個曲線，就是看看分群的準(zhǔn)確性如何。也就是說，把表達CD72當(dāng)成真實分群，然后算cluster4和5的ROC（??這個思路有意思，后續(xù)研究一下畫法）。（這部分是使用AUCell做的。）
E：CD72的水平和促炎因子Tnf, Il1b、趨化因子Ccl2, Ccl4和促纖維形成因子Tgfb1呈正相關(guān)。這張圖是使用corrplot做的。

F：對CD72陽性的巨噬細(xì)胞進行功能富集，富集到了兩條巨噬細(xì)胞相關(guān)通路：巨噬細(xì)胞趨化和巨噬細(xì)胞遷移
G：為了驗證前面的結(jié)果，使用流式檢測了兩種心衰小鼠模型（TAC和AngII）心臟中巨噬細(xì)胞CD72的表達，結(jié)果都顯示心衰小鼠心臟巨噬細(xì)胞表達CD72增加。
H：心衰小鼠的左心功能與巨噬細(xì)胞CD72的表達呈負(fù)相關(guān)。

2. Rel是驅(qū)動CD72^hi巨噬細(xì)胞數(shù)目增加的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

A：為了探究CD72^hi巨噬細(xì)胞的來源，作者計算了CD72和巨噬細(xì)胞一些經(jīng)典marker的相關(guān)性。結(jié)果顯示Cd72和Ccr2有很好的相關(guān)性，提示CD72^hi巨噬細(xì)胞可能屬于髓系來源的CCR2+巨噬細(xì)胞。
B：對所有單核和巨噬細(xì)胞進行monocle擬時序分析的結(jié)果顯示在單核向巨噬的分化過程中，CD72表達增加。進一步驗證了CD72^hi巨噬細(xì)胞是由單核分化而來的。
C：對與CD72高度正相關(guān)的基因、轉(zhuǎn)錄因子和差異基因（logFC>1）取了交集，得到2個與CD72高度正相關(guān)的差異表達轉(zhuǎn)錄因子Rel和Rbpj。（高度正相關(guān)的高度定義值沒有給出，轉(zhuǎn)錄因子list也沒有給出）
既往研究報道Rbpj是單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。（就這樣排除掉了Rbpj對CD72^hi巨噬細(xì)胞的作用？）

D：monocle查看一些基因隨細(xì)胞狀態(tài)等的表達變化結(jié)果顯示Rel表達高峰的時間點與CD72表達變化曲線相吻合，提示巨噬細(xì)胞表達CD72可能受到Rel調(diào)控。
E：為了證實這一點，作者進行了單核巨噬細(xì)胞系(THP-1和RAW 264.7)的ChIP-Seq分析。在人源巨噬細(xì)胞THP-1和小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，ChIP-Seq的峰值都位于CD72的調(diào)控區(qū)。
MEME工具做的motif預(yù)測得到5個CD72 promoter，其中包括Rel motif。熒光報告基因也證實了這個結(jié)果。（在supplementary Fig 7A, B）
F：Interestingly，常用來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的IL10和LPS對CD72表達沒有影響。而IFN-gamma和cytosolic extracts from mouse cardiomyocytes顯著增加了BMDM中CD72表達。這個結(jié)果提示心肌損傷可以直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CD72表達。
G：在體內(nèi)，移植了Rel過表達骨髓的小鼠，巨噬細(xì)胞CD72水平明顯增加。
小結(jié)：Rel may be a key factor driving CD72^hi macrophages.

3. Rel驅(qū)動BMDMs誘導(dǎo)的心肌損傷具有CD72表達依賴模式

A：心肌和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。心肌細(xì)胞與過表達Rel的BMDM共培養(yǎng)，心肌負(fù)荷指標(biāo)(Anp和Bnp)和氧化酶類(Cybb, Sod2, Gsr和Prdx5)表達增加。而與CD72過表達的BMDM共培養(yǎng)，這些指標(biāo)沒有顯著變化。
B：兩種共培養(yǎng)對心肌細(xì)胞面積影響不大
C：與過表達Rel的BMDM共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞胞質(zhì)ROS水平顯著升高
D：與過表達Rel的BMDM共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)容物(?)增加，但ATP產(chǎn)生下降?？赡艿脑蚴菗p傷的線粒體數(shù)目增加
E&F：有趣的是，盡管cd72過表達的BMDM對心肌細(xì)胞損傷更小，CD72敲除顯著減輕了Rel引起的ATP產(chǎn)生減少和細(xì)胞死亡，提示Rel的破壞性作用是CD72依賴的。
G：給予anti-Tnf 和anti-IL6的抗體，死細(xì)胞的也減少，提示細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)可能與促炎性細(xì)胞因子的作用有關(guān)。
小結(jié)：In summary, our data showed that Rel-driven CD72^hi BMDMs can induce apoptosis and reduce ATP production in cardiomyocytes in vitro, which is dependent on CD72 expression.

后面就是模式小鼠上的機制研究了，做的也比較常規(guī)。

Key Points：

1. Sup Fig1 用AUCell和training set+validation set來看得到的單細(xì)胞和既往文獻報道分群的符合度
2. Fig1用單個基因來對不同細(xì)胞群的區(qū)分度來鑒別細(xì)胞群