上回說到，基因功能研究，最常用的策略就是功能獲得和功能失活。基因過表達、基因干擾、基因敲除，這三板斧揮出去，配合下游的轉(zhuǎn)錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角。

基因過表達技術，通常是指將目的基因的ORF構(gòu)建到組成型啟動子或組織特異性啟動子的下游，通過載體轉(zhuǎn)入某一特定細胞中，實現(xiàn)基因表達量增加的目的，可以使用的載體類型有Virus-Free轉(zhuǎn)座子載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體等多種類型。當基因表達產(chǎn)物超過正常水平時，觀察該細胞的生物學行為變化，從而了解該基因的功能。

CRISPRa(轉(zhuǎn)錄激活)，作為基因過表達技術的新成員，是通過催化失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子，來實現(xiàn)促進基因組特定位點的轉(zhuǎn)錄。

目前CRISPRa已經(jīng)發(fā)展出好幾個新版本。MIT的CRISPR先驅(qū)張鋒通過改造dCas9和sgRNA優(yōu)化了轉(zhuǎn)錄機器的招募，成功將RNA表達水平提升了一個數(shù)量級。張鋒團隊用自己的改良版CRISPRa激活了十個基因,研究顯示，這些基因的轉(zhuǎn)錄都得到了兩倍以上的增漲，許多基因的活性甚至有了幾個數(shù)量級的增加。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPRa離轉(zhuǎn)錄起始位點越近，轉(zhuǎn)錄激活的效果就越強。如果CRISPRa靶向轉(zhuǎn)錄起始位點的上游（超過200bp），觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄就會更為溫和，更接近生理水平。通過這一途徑揭示了基因表達量與表型強度之間的線性關系。

加州大學的Jonathan Weissman研究團隊在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當于一套分子掛鉤，能在細胞中招募多拷貝的轉(zhuǎn)錄激活子，生成強勁的信號。

綜合看CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源性基因的強大工具。完整的CRISPRa系統(tǒng)包含三個組分，每個組分分別由單獨的載體提供：gRNA/MS2表達載體，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64輔助載體。

gRNA/MS2表達載體，包括兩個138-nt發(fā)夾RNA適體，形成噬菌體MS2衣殼蛋白的結(jié)合位點。這些發(fā)夾RNA適體與gRNA連接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1輔助載體驅(qū)動由MS2，p65（NF-kB的反式激活亞基）和HSF1（人熱休克因子1的激活結(jié)構(gòu)域）組成的三結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達。

dCas9/VP64輔助載體驅(qū)動催化失活變體dCas9和合成型VP64反式激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達。

當這三種載體共轉(zhuǎn)導細胞時，用戶定制的gRNA可能會募集MS2/P65/HSF1（通過MS2結(jié)合發(fā)夾適體與gRNA連接）和dCas9/VP64（通過CRISPR/Cas9復合物組裝） 到gRNA靶位點，從而組裝出強大的SAM復合物。這些SAM復合物可通過VP64，p65和HSF1激活結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用實現(xiàn)靶位點的強烈轉(zhuǎn)錄激活。

該載體系統(tǒng)可用于激活單個或一系列基因的轉(zhuǎn)錄，也可用于基因組的大規(guī)模篩選，使用gRNA序列文庫來產(chǎn)生gRNA/MS2表達載體文庫。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPRa vs ORF傳統(tǒng)過表達技術

相比于傳統(tǒng)ORF穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達技術，CRISPRa通過激活內(nèi)源性啟動子高效轉(zhuǎn)錄，從而促進基因表達，不需要額外構(gòu)建外源性表達元件，不受基因轉(zhuǎn)錄本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技術在長轉(zhuǎn)錄本基因過表達研究、單基因多轉(zhuǎn)錄本的整體激活研究具有不可替代的優(yōu)勢。

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